抗体偶联药物（ADC）作为一种生物治疗候选药物是近年来的研究热点。ADC药物是将单克隆抗体的肿瘤特异性和靶向性与高效的小分子药物的细胞毒性结合成一个新的药物分子，从而形成有效的抗癌治疗剂。这些分子由三部分组成：单克隆抗体、稳定的连接物以及细胞毒性小分子药物。
ADC药物的药效和清除率都与药物抗体偶联比（DAR）值有关，因此在药物开发过程中必须对其精确分析。尺寸排阻色谱法和疏水色谱法是在天然生理条件下检测DAR的两种最常用的方法。
在本应用中，我们通过SEC-MS和HIC-UV法来对一个半胱氨酸偶联的ADC药物模拟物进行分析。该模拟物是由LC-SMCC交联剂将丹磺酰基萤光团共价键合到IgG1-mAb上，形成一个载药量不同（0-8）的抗体混合物。
图1. 半胱氨酸偶联的ADC模拟物
图2. 半胱氨酸偶联的ADC的异质性
在SEC-MS方法中，我们选用了TSKgel SuperSW3000尺寸排阻色谱柱。将ADC注入该色谱柱中，HPLC系统与质谱相连，用于检测DAR谱图。
从谱图中观察到，每个主峰之间的分子量差异为1336 Da，对应两个丹磺酰基荧光团分子的分子量。SEC/MS分析表明，平均DAR为3.9 。
图3. ADC模拟物的SEC/MS谱图
然后，使用TSKgel Butyl-NPR疏水色谱柱和UV检测，来确认DAR分布情况。mAb抗体结合的药物分子数越多，ADC的疏水性越大，在HIC固定相上的保留时间更长，载药量不同的组分便可得到分离。从DAR谱图中可以看到，DAR=0-8的各峰之间分离情况很好。
图4. ADC模拟物的HIC-UV谱图
SEC-MS和HIC-UV是有效表征ADC的DAR谱图的两种方法。在TSKgel SuperSW3000色谱柱上，使用了质谱兼容的流动相，通过高分辨率ESI-MS检测，验证药物模拟物中ADC组分的分子量。
HIC-UV方法中，使用TSKgel Butyl-NPR色谱柱对样品中各种抗体-载荷的ADC异构体进行疏水性分析，进一步确认其DAR分布。结合这两种分析方法，可以有效验证ADC生物大分子的DAR谱图。
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