赖氨酸偶联ADC药物LC-MS表征的正交技术

基于赖氨酸的偶联是一种广泛用于抗体药物偶联 (ADC) 开发的非特异性偶联策略，产物具有高度异质性，这对当前的表征分析方法提出了挑战，如：

后两者是重要的质量属性，一般通过Bottom-up方法来确定，并且通常使用赖氨酸特异性蛋白酶（胰蛋白酶或 LysC）进行酶切。赖氨酸偶联产生的可变修饰，会导致此类蛋白酶产生复杂的肽混合物，不利于量化位点占用率。

因此，我们提出了一种基于精氨酸特异性蛋白酶 RgpB（GingisREX^®，Genovis AB）的分析策略。

使用肽图谱数据，对完整分子量进行重建，从而确定分子量和肽图谱之间的正交相关性分析。

使用固定在磁珠上的 PNGaseF ，在 PBS 中， 37°C 30 分钟，自动对曲妥珠单抗美坦新进行去糖基化。在配备了 Waters™ BioResolve™ RP mAb 柱 (2.1 x 50 mm) 的 Waters™ BioAccord™ 系统上，通过反相 LC-MS 对所得样品进行完整分子量水平分析。

使用固定在磁珠上的 PNGaseF ，在 PBS 中，样品在 5 M Gnd-HCl、3 mM DTT 中，于室温下还原变性 30 分钟，然后用 7 mM IAA 烷基化 20 分钟。通过添加 14 mM DTT 猝灭 IAA，并用 RapiZyme 胰蛋白酶水解缓冲液 (Waters) 将溶液稀释至 0.6 M Gnd-HCl。以 1:5 的比例添加 RapiZyme 胰蛋白酶 (Waters)，然后在 37°C 下水解 2 小时。通过添加0.1%乙酸终止反应。所得肽在 Waters™ ACQUITY Premier CSH C18 色谱柱 (2.1 x 150 mm) 上进行分离，并在 Bruker Impact II QTOF 质谱仪上进行 MS/MS 分析。

样品在 7.9 M 尿素、5 mM DTT 中于 30°C 还原变性 30 分钟，然后用 10 mM IAA 烷基化 30 分钟。通过添加 11 mM DTT 猝灭 IAA，并将浓度调整至 1 mg/ml 抗体和 6 M 尿素。以 1:50 的比例添加 RgpB，然后在 30°C 下水解 4 小时。通过添加1%甲酸终止反应。所得肽在 Waters™ BioResolve™ RP mAb 柱 (2.1 x 150 mm) 上分离，并在 Bruker Impact II QTOF 质谱仪上通过 MS/MS 进行分析。

在血浆中孵育后观察到 DAR 降低，蓝色阴影区域显示肽图数据重建的完整分子量信息。

为了评估 RgpB 的特异性以及准确检测和鉴定水解产物的能力，使用未偶联的曲妥珠单抗进行对照酶切。

仅从精氨酸末端肽观察到完全覆盖，并且未观察到赖氨酸处的酶切，显示出高特异性。

Byos 中的 PTM 模块使用Byonic™ 搜索引擎根据 MS2 光谱鉴别肽。所有精氨酸末端肽均基于 MS2 碎片离子进行可靠鉴定。

最长肽是根据上图所示带注释的 MS2 谱图确定的。MS1 同位素图进一步验证了这一鉴定。绿色条显示理论（基于平均）同位素分布。

该表显示了对照和孵育血浆样品之间偶联（非位点特异性）和未偶联肽的标准化 XIC 面积的比较。出于报告目的，隐藏了未偶联肽的百分比。

ADC模块将使用该定量信息以执行完整分子量的重建。在此过程中，氨基酸水平的偶联相互卷积以重建理论上的完整分子量质谱。将理论重建的完整质谱与实验光谱进行比较，提供了一种将肽图谱数据与完整分子量分析进行比较的方法。然后可以使用两个光谱之间的差异来比较两种方法之间的相关性。

在此示例中，三种肽型被准确地鉴定并定量。Delta Mod.Score确认了修饰位点，分数是根据两个可能位点之间是否存在 MS2 碎片离子来计算的。该表显示了基于归一化 XIC 面积的每种肽型的相对量。

本工作展示了两种用于量化曲妥珠单抗美坦新赖氨酸偶联的正交技术。

使用精氨酸特异性蛋白酶 RgpB 水解 ADC 可以得到更简单的水解谱图，有助于更清晰地确定肽定量，并在某些情况下确定位点占用比。

分析化学的一项挑战是需要以系统的方式比较正交方法。完整分子量重建直观地证实从肽图谱获得的定量数据与完整分子量分析的相关性。

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