小编在《新药研发中HCP那些事（上）》中，介绍了HCP ELISA检测技术，以及美国和欧盟药典中，推荐的基于荧光标记的HCP ELISA抗体覆盖率评估新方法： 差异荧光印迹电泳（DIGE/DIBE）技术。本期，我们详细介绍下DIBE技术的工作原理、胶点匹配流程和HCP ELISA Coverage的计算方法。
同上期所述，评估HCP ELISA抗体覆盖率的最佳方案是双向电泳与蛋白免疫印迹技术结合的办法，但是传统的双向电泳技术，由于每一块胶只能实现一个通道样品的成像，并且凝胶间存在不可控的差异、凝胶的形变以及化学发光的一次性成像等因素都会直接影响实验结果的重复性变差，导致胶点匹配的难度加大，这些都将严重制约HCP ELISA抗体覆盖率的评估。
差异荧光印迹电泳技术，可以实现一个样本，只需一块凝胶，得到可靠的HCP ELISA抗体覆盖率评估结果。
差异荧光印迹电泳技术的工作原理是： 电泳前将样品用CyDye 染料Cy3标记总蛋白，双向电泳分离后，直接转膜，封闭，将HCP测试抗体最为一抗，进行第一次孵育，二抗使用CyDye染料偶联。二抗孵育完成后，无需使用任何发光液，直接可用于多通道激光扫描成像。印迹膜也可干燥避光保存数月，随时取出反复观察。
实现上述的DIBE技术，得益于三个方面：
首先，高灵敏的CyDye染料，如下图与银染灵敏度的对比。
其次，高信噪比的扫描成像设备和防淬灭的全自动模式。
全光谱双PMT检测器
多荧光通道全自动扫描成像
最后，HCP ELISA Coverage专用分析软件。
自动匹配胶点，2D/3D追踪显示。
实现HCP ELISA Coverage的自动计算和结果评估。
那么，能否使用CCD拍照式成像实现DIBE技术？我们做个小小地验证，会发现采用共聚焦模式的扫描成像仪比高灵敏的CCD成像的图像信噪比强太多。
最终导致CCD拍照的图像，大约有10%的胶点“丢失”。
首页
