新药研发中HCP那些事（上）

宿主细胞是生产诸如重组蛋白、抗体和疫苗类药物的上游材料，不同用途的药物会采用不同的宿主细胞，重组蛋白类药物常用的细胞有中国仓鼠卵巢细胞（CHO），新型疫苗常采用非洲绿猴肾细胞（Vero）、犬肾细胞 （MDCK）、昆虫细胞、人二倍体细胞，传统疫苗还会采用大肠杆菌、鸡胚等作为宿主细胞。

非生物类的小朋友们，可能被隔着屏幕的名称恶心到了吧。

别太介意，更恶心的，小编还没放呢！

宿主细胞蛋白如果残留在药物制剂中，会引起人体的免疫应答——过敏反应，如：发热、水肿，甚至休克等。人体的免疫应答性质和效果，会受到HCPs的浓度、数量和个体免疫系统差异影响而不同。药物监管部门最关注患者用药的安全性，所以HCPs的监控变得越来越重要。作为药企来说，药物研发周期很长，成功率也很低，投入和产出不是直接划等号的，因此在药品研发的中后期，药企也会非常关注生产工艺设计过程中HCPs的控制。因为，药物中HCPs残留量会影响临床试验效果，国外曾有报道，由于药企开发的新药在临床实验中出现免疫反应，导致临床实验推迟、搁置或重新设计工艺，如：易普森公司，凝血因子9(IB1001) 临床实验在2012年被搁置，2017才获批。

药品即使被成功开发，但如果想进入不同国家的市场，还要达到当地药物监管部门的标准，所以药企都会遵照不同国家药典要求，严格建立HCP监控体系。中华人民共和国药典2010年版第三部就明确规定CHO细胞残余蛋白占总蛋白含量要小于0.05%以下；对Vero细胞残余蛋白会随不同产品而异，ELISA方法检测法每个剂量不高于2微克或4微克。美国FDA认为可以接受的范围为1-100/100万，即1-100个PPM。

当前，广泛被使用于HCP检测的方法是双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）。在药物研发中，通常会建立通用和专属的HCP ELISA方法。前期可以采用通用HCP ELISA试剂盒。到临床实验时，药企会采用专属试剂盒，即工艺特异HCP ELISA试剂盒，需要单独纯化HCP蛋白，免疫筛选抗体。

HCP ELISA的原理是先将HCP抗体包被酶标板，孵育待测样品，通过HCP抗体捕获和富集样品中HCPs，再加入与包被酶标板的抗体种属不同的，酶联报告基团的HCP抗体，结合已被富集的HCPs，通过底物显色或荧光的方式成像，最终定量计算HCPs。

HCP ELISA的方法具有特异性强、灵敏度高、通量大和使用方便等特点，但也存在风险：

•  ELISA方法能够富集的HCPs至少要具有两个及以上的表位。

• 当两个表位被抗体结合时，不能存在空间位阻。

• ELISA酶标板包被的抗体结合量低，会限制HCP检出限。

• 不是所有HCPs都可以作为抗原产生抗体，因此会有“漏检”，所以需要评估HCP ELISA抗体的覆盖率（Coverage）。

HCP ELISA抗体覆盖率的评估方法一般会采用双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）和蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）技术结合的办法。

首先，双向电泳是利用蛋白质的等电点和分子量的微小差异，在凝胶内进行分离，一块凝胶只能实现一个生物样本的分离，HCPs在胶内会形成许多独立的胶点。一个样本至少要准备两块重复凝胶，电泳后，将凝胶从玻璃板中取出一块凝胶直接用于HCPs总蛋白的染色成像，另一块凝胶进行化学发光免疫印迹操作：转膜、封闭、抗体孵育、洗膜，加入发光液后，拍照成像。最后，将分别得到的HCPs总蛋白分离图像和HCP抗体结合的图像放在一起叠加、匹配胶点、分别记录匹配和未匹配的胶点数量，计算覆盖率结果。

如果上述的过程一切顺利，那代表了诗和远方。

这种普通双向电泳与化学发光蛋白质免疫印迹组合的方法,由于化学发光成像和总蛋白的染色成像，并不是同一块凝胶的结果，凝胶间差异和凝胶扭曲形变，无法自动修正，因此会导致胶点匹配难度大，大多数同行就是在这个环节累吐的。

接下来给大家介绍个新方法——荧光差异印迹电泳技术（DIBE，Differential In Blot Electrophoresis）。美国药典（United States Pharmacopeia ，USP）的 [1132] Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals 和欧盟药典 （European Pharmacopoeia 9.1）中2.6.34 HOST-PROTEIN CELL ASSAYS 中，都推荐使用差异荧光电泳技术（DIGE/DIBE），作为表征HCPs抗体覆盖率的新方法。

差异荧光印迹电泳技术可以实现一个样本，只需制备一块凝胶，最终在同一张印迹膜上，展示两个荧光通道，一个是HCPs总蛋白，另一个被抗体识别覆盖的HCPs。DIGE/DIBE技术避免了胶间差异和凝胶形变，配合HCP专用分析软件，自动胶点匹配，2D/3D全程跟踪式显示匹配效果，并且直接计算覆盖率结果。