上周小编向大家介绍了微载体的优势、选择和使用关键，今天我们将继续“微载体之月”来看看相关应用分享，微载体在WAVE波浪形生物反应器中球转球应用以及Vero细胞的放大培养。
Vero细胞
Vero细胞最初起源于非洲绿猴肾，已知对多种病毒都很敏感，因而被广泛应用于针对相应疾病的疫苗开发。知名制药企业百特公司（Baxter Healthcare）就成功利用过Vero细胞生产流感疫苗。作为贴壁细胞，Vero细胞在小规模状态下可以用T型培养瓶或者滚瓶来进行培养，如果需要较大规模的生产型培养，则在生物反应器中进行微载体培养是最佳的选择。而要规模化生产微载体上的细胞培养，需要解决放大的问题，其中重要的环节是如何把细胞从其已经生长的微载体转到新的没有细胞生产的微载体上。衡量这一技术是否成功，一方面固然是转移是否成功，同样重要的是转移后细胞是否能有同样的生长状态。
球转球前的细胞准备
在10升的WAVE细胞培养袋中，Vero在微载体Cytodex 1上进行贴壁培养，微载体浓度是3g/L悬浮培养体积为2L。在接种前一天，细胞培养袋先被放置到WAVE反应器上，充满10% 二氧化碳加入1.5L的培养基以及微载体，并在37℃摇动过夜以使温度和pH得到充分平衡。接种当天，用胰酶细胞从细胞工厂中消化下来，重新悬浮于新鲜的培着基中并转移到预先平衡的细胞培养袋中，细胞接种密度控制在每毫升3-5*10E5个细胞。培养条件是，摇速11rpm,角度4度，温度37℃，pH控制在7.0-7.3之间。根据葡萄糖的代谢情况适时通过用新鲜培养液替换培养袋内的培养液来补充营养。每天采样监测细胞生长速度和状态。在细孢密度达到约每毫升2-3×10E6个时，进行球转球实验。每次球转球实之后，细胞在WAVE反应器内用上述同样的方法来进行数天的培养，观察生长状况。
在瓶子内进行球转球实验
在WAVE反应器内细胞密度达到需要的水平，Vero细胞微载体培养悬浮液即被转移到另外一个透明的瓶子中并移到生物安全柜中。后面的清洗和胰酶消化过程等在生物安全柜内进行。在微载体沉降下来之后，去除上清。剩下的微载体被转到5毫升无菌透明的瓶子内（这是根据2升培体积所需的瓶子大小，不同的情况应有不同的需求〕。尽量多地去除上清。加入400毫升37 ℃预热含0.02% EDTA磷酸缓冲渡(PBS-EDTA),适当混合，待微载体沉降后去除上清。以上同样的过程重复4次以使微载体得到充分洗涤。
长有细胞的微载体在用PBS-EDTA充分洗涤之后，即用0.02% EDTA的0.25%胰酶消化。2升的培着体积（6克微载体〕，胰酶用量为300毫升，预先在37 ℃预热，在与微载体混台之后置于37 ℃中每隔10分进行一次充分的混合。25-30分钟之后，根据所需要的接种密度和稀释倍数，取一部分细胞-微载体-胰酶混合悬浮液到一个干净的无菌转移瓶内，与新鲜培养基混合并接种到一个新的培养袋中开始新一轮的培养。
在WAVE培养袋内进行球转球实验
在WAVE反应器内细孢密度达到需要的水平时，球转球实验在WAVE培养袋内进行。实验开始前，准备装有5-10升PBS-EDTA的液体转移瓶和溶积5-10升的废液瓶，灭菌。准备1升的液体移瓶两个，灭菌，并在无菌条件下分别装入胰酶和新鲜培养基。将PBS-EDTA、 胰酶和新鲜培养基分别预热至37 ℃。在无菌条件下（如无菌焊接机）将这个瓶子与细胞培袋接通。整个实过程中细胞培养袋被置于反应器上。反应器停止摇动并停止加热以防过热或不均匀加热。培养袋内长有Vero细胞的微载体会在数分钟内沉到底部。用泵把尽量多的上清液转移至废液瓶。加入一定量的PBS-EDTA，轻柔混匀后，再次沉降微载体并移去上清。如此重复三次，每次使用PBS- EDTA的量不超过一个培养体积。长有细胞的微载体在用PBS-EDTA充分洗涤之后，与 37 ℃预热的含0.02%EDTA的0.25%胰酶混合（用量约 20%的培着体积，如这里使用的是400毫升〕。10分钟轻柔摇动混合一次。25-30分钟后，细胞培养袋内的悬浮液被转移至一个空的无菌转瓶内。用少量新鲜培养液淋洗培养袋一次并和前面的台并。根据所需要的接种密度和稀释倍数，接种新的细胞培养袋并开始新一轮培养。
球转球实验结果：
各次球转球实验情形
共有三次球转球实在10升的细胞袋中进行。其中一次在细胞袋外的瓶子中进行，两次在WAVE细胞袋内进行。第一次和第三次实验的Vero细孢来自通过细胞工厂接种到细胞袋中并生长起来的细胞，而第二次实验的Vero则直接来自第一次球转球实验后接种并培养起来的细胞。
球转球前后细胞生长曲线
每次球传球前后的细孢生长情况都通过每天采样来监测。图一和图二显示的就是根据每次培养每天细胞密度的增长情况绘制的细胞生长曲线。把相关联的放在一起比较。其中图一显示的是B2B # 1、B2B#2 之前和之后细孢生长曲线，而图二显示的B2B #3之前及之后的细胞生长情况。我们可以看到在各次球转球实前后，细胞都保持着良好的生长活力。在球转球实验之后，因起始细胞密度相比初始种子培养稍低，因此需要一天时间达到相似的细胞密度。总体来说，细胞生长的速度基本相同。
球转球前后细胞在微载体上的生长形态
图3和4显示的是球转球前Vero细孢在微载体上的生长情况，分别有接种前第一、第三和第五天细胞的形态。图4的上面三张小图显承了球转球实验B2B #3之前来自细胞工厂种子培着詢细胞生长形态。这是典型的Vero细孢种子培养的生长情况。通常90%以上的Vero细胞会在接种4时之内贴到微载体上并在24小时内进入对数生长期。从图3和图4中各次球转球实之后Vero细胞在微载体上的生长情况，可以看到球转球实验之后细胞保持有良好的和种子细胞培养相以的生长形态。
结果讨论
通过瓶子里或直接在细胞袋中的细胞和微载体分离的方法，WAVE反应器中的球转球实验能够成功进行。转移之后Vero细胞能保持和种子细胞相似的生长特征，证实Vero细胞微载体培养技术在WAVE反应器中的放大策略可行。生长在微载体上的Vero细胞用37℃预热的PBS-EDTA洗涤，用37℃预热的胰酶进行处理，胰酶处理的时间不超过40分钟，转移过程中没有必要把细胞和旧的微载体分开。
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