更全更准更快，氢氘交换质谱技术助力表位研究

沃特世

2020.4.02

沃特世科技（上海）有限公司

表位是蛋白质抗原性的基础，研究蛋白质抗原表位对于设计具有免疫原性和中和活性的新型疫苗分子、新型诊断试剂、多肽、治疗性抗体等具有重要意义。

蛋白研究前沿领域兴起的氢氘交换质谱技术（HDX-MS)，可以直接提供哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等信息。

图1：HDX-MS用于蛋白质动态结构研究

John Engen, Northeastern University, Chem and Engg News (2012)今天，小编来和大家分享下科学家们在抗原表位研究中应用HDX-MS的案例。

更全面提供表位结构信息：用于抗原-抗体相互作用研究

用功能性单抗进行的表位识别的定位对于理解免疫反应的性质以及疫苗、治疗方法、诊断方法的设计改进至关重要。近年来，以中和抗体为靶点的B细胞表位鉴定为设计抗HIV、呼吸道合胞病毒、幽门螺旋杆菌等高变异病原体的基于肽段的疫苗提供了便利。但这些产品尚未进入临床阶段。传统定位技术鉴定的线性表位只能部分反映表位在自然构象中的免疫原性。

Novartis疫苗与诊断研究中心的科学家Enrico Malito等研究了抗原-抗体相互作用并评估常用表位定位技术的潜力，制备了一系列针对于脑膜炎奈瑟菌关键独立因子和疫苗抗原的抗fHbp(factor H binding protein)单抗，采用多种表位定位方法研究了fHbp与杀菌单抗12C1之间的相互作用。

■ 采用两种样品制备方法，持续标记策略：

- fHbp获得97% 序列覆盖

- fHbp +抗体

■ 7个肽段、4个不连续碎片，有效减少氘交换

■ HDX-MS能够快速提供表位结构全方面的信息

图2：多种鉴定抗原表位方法鉴定结果对比图 [PNAS, 2013,110(9), 3305-3309]

图3：HDX-MS表位结果图

>>>左右滑动，查看更多<<<

作者指出，虽然通过肽扫描和噬菌体展示文库筛选，在fHbp的C端发现了一个12-残基表位，但HDX-MS和X射线晶体法表明mAb 12C1在fHbp上占据了1000 Å²的面积，其中有20个以上的fHbp残基分布在fHbp的C末端和N末端。数据表明，线性表位定位技术提供了对B细胞表位有用的信息，但描述并不完整，因此需要更多的努力全面描述抗原-抗体界面，以了解和设计有效的免疫原 — HDX-MS可以高效、快速地提供表位结构全方面的信息。

更准确确定靶标：用于抗体-病毒颗粒复合体表位与补位的研究

对病毒结构和表面抗原的深入了解，能揭示病毒感染细胞和药物发挥作用的分子机制，是研究病毒防治和药物研发的基础。HDX-MS在病毒结构研究中也有广泛应用，包括：病毒抗原表位鉴定，病毒衣壳折叠、聚集、组装和成熟，病毒结构变化和动力学，病毒-细胞膜融合等。

新加坡结构生物学家、新加坡国立大学生物科学系教授Ganesh Anand博士带领团队专注于开创一条全新的探索之路，利用HDX-MS取得登革热病毒研究重大突破：成功将登革病毒碎裂成肽段，借助数字技术重新装配，确定了其易受攻击的靶标。并在Nature Communications（《自然通讯》）和Structure上的发文，独家揭秘登革热病毒（DENV）。

图4：病毒与抗体表位结合研究的工作流程

图5：2D22的抗原表位与补位：非膨胀的整个DENV2复合体

图6：2D22的抗原表位与补位：膨胀的整个DENV2复合体

图7：两种血清型不同的登革热病毒DENV1和DENV2的完整病毒颗粒随温度变化的结构膨胀（structural expansion）和动力学。（Nat. Commun. 2017, 8, 14339）

>>>左右滑动，查看更多<<<

更快速鉴定抗原位点：用于流感病毒血凝素抗原表位的药物筛选

表位表征对于解析候选药物的作用机制至关重要。传统的X射线晶体衍射方法，常常需要耗费大量时间才能采集蛋白质晶体的数据，而由于蛋白内在的复杂性以及具体操作时很难获得理想的单晶，这种方法不容易成功，在需要大量筛选候选药物识别相似靶点时并不现实。核磁共振技术(NMR)又时常受限于蛋白质的分子量。

Janssen疫苗与预防研究中心采用HDX-MS开发不同药物分子与血凝素HA结合后的构象影响，基于沃特世氢氘交换质谱平台，系统地探究了距离相关的HA亚型复合4种不同的药物（包括单克隆抗体和小分子合成肽）候选物后的表现。这种快速、低成本的HDX-MS表位方法准确地鉴定了所有情景下的主要抗原位点。

此筛选策略在早期药物发现中具有如下优势：

■ 样品量需求小

■ 采集及分析耗时短

■ 不受分子量的限制

■ 天然环境下的蛋白质动态数据

图8：氢氘交换揭示了游离与结合Fab的血凝素（HA）三聚体动态构象

图9：准确确定四种候选药物分子的流感病毒抗原血凝素（HA）的抗原表位，并揭示了其对HA构象动力学的不同影响。（Sci. Rep. 2019, 9, 4735）

蛋白质结构分析的新兴手段
作为一种分析蛋白质结构及其分子动力学的方法，HDX-MS主要用来帮助科学家深入理解蛋白质的结构变化。近年来，应用这项技术在顶级期刊发表的论文与日俱增。据统计，从2015年到2018年发表在Nature及其子刊的相关文章有四五十篇之多。该技术在抗原与抗体相互识别的研究、新型疫苗的研制以及药物的开发等方面具有广泛应用前景。来自BMS公司的Guodong Chen对c&en杂志谈到：抗原表位是开发新的蛋白制剂非常重要的方面，定位一个有希望的抗体表位能够带来明显的商业结果，表位信息对专利保护非常关键。