肌萎缩性侧索硬化症（ALS）也称渐冻症，是进程迅速、致死率高的运动神经元疾病。额颞叶痴呆（FTD）属于第二大家族遗传性认知障碍，主要影响人格、社会行为和语言功能。C9orf72第一内含子中的六核苷酸（GGGGCC）重复扩增（HRE）是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的遗传原因。C9-HRE产生的RNA和二肽重复序列破坏了核质运输，其引起的蛋白质重新分配、及下游机制仍然未知。
2020年4月8日, 美国芝加哥市西北大学范伯格医学院神经病学Evangelos Kiskinis研究团队在Neuron(IF=14.4)在线发表题为" Nucleocytoplasmic Proteomic Analysis Uncovers eRF1 and Nonsense-Mediated Decay as Modifiers of ALS/FTD C9orf72 Toxicity"的研究成果。研究人员利用亚细胞分离和串联质谱技术，鉴定了126种核质蛋白质，丰富了蛋白质翻译和RNA代谢途径。为跨神经退行变性相关重复扩增突变中核质全蛋白质组改变提供了资源，并强调翻译终止因子eRF1和无义介导的mRNA降解（NMD）是C9orf72相关ALS和/或FTD的治疗靶点。
研究材料
对照组：HEK293-GFP
疾病组：HEK293-(G4C2)x8，HEK293-(G4C2)x58，多能干细胞（iPSC）衍生运动神经元细胞，果蝇RNAi干扰的果蝇株系
技术方法
亚细胞器蛋白组学分析
实验路线图
研究结果
1、科学问题提出：C9orf72扩增导致核质全蛋白质的再分配
为了确定C9-HRE是否影响核质蛋白质的分布，作者在HEK293细胞中表达了G4C2重复序列（分别为8或58）和对照组GFP，经使用荧光激活细胞分选术(FACS)和亚细胞分离获得核蛋白和胞质蛋白进行质谱分析。每个样本约鉴定到10000个蛋白质，核质比分析发现，(G4C2)x58细胞中蛋白质组的平均细胞溶质比显著高于GFP或 (G4C2)x8细胞；采用TdTomato 报告基团，及添加核输出蛋白抑制剂kpt-330处理，也发现在C9x58表达细胞中TdTomato信号明显表现出与胞质相关。上述结果表明，表达C9x58的细胞经历了蛋白质的重新分布，更多的蛋白质聚集在细胞质中，并且受损的核质运输可能与其他神经退行性疾病有广泛的联系,如脊髓小脑共济失调1型（SCA1）和亨廷顿病（HD）。
图1 C9-HRE导致核质蛋白质的重新分布
2、蛋白组学分析：C9orf72重复序列的扩增导致参与RNA代谢和蛋白质翻译的蛋白质重新分布
在表达C9x58的细胞中，统计发现126种独特的蛋白具有显著的核质比改变。该类蛋白占总鉴定蛋白质总数1.2%，并且都呈现双向变化，即56%从细胞核转移到胞浆，44%向相反方向转移（核质交换蛋白主要通过NPC进行主动转运）。接下来作者对126个重新分配的蛋白质进行GO功能分析，发现RNA代谢、蛋白质翻译和细胞周期相关的蛋白质的显著富集（图2D和2E），综上，C9-HRE可引起重要的、高度特异性的主要细胞功能蛋白再分配，包括RNA代谢和蛋白质翻译。
图2 C9-HRE导致参与RNA代谢和蛋白质翻译的蛋白质重新分布
3、果蝇层面功能验证：再分配的蛋白是C9orf72重复扩增毒性的遗传修饰因子
依据蛋白表达量变化和细胞通路富集分析结果，作者选取六种蛋白（eRF1、TNPO3、PRMT1、 ENY2和CCT8）的果蝇同源基因进行RNAi功能验证，以坏死斑、外眼表面塌陷和色素脱失作为观察指标，eRF1是两种果蝇模型中G4C2毒性最强的增强剂（图3C），翻译终止因子eRF1表达含量的降低能增强HRE引起的运动功能障碍。相反，过表达能显著抑制由G4C2 repeat引起的外眼变性、坏死斑和色素脱失（图3D、3E）。这些结果表明，eRF1通过直接或间接控制C9-DPR水平调节C9-HRE的体内毒性。
图3 在果蝇疾病模型中，再分配的蛋白是9orf72重复扩增毒性的遗传修饰因子
4、体内体外功能验证：eRF1在C9orf72诱导的多能干细胞（iPSC）衍生运动神经元和死后ALS组织中再分配
为进一步明确eRF1再分配是否在生理相关疾病模型系统中更具有意义，作者分化了人类运动神经元(MNs)。发现eRF1在细胞核富集，并且eRF1在C9 ALS患者运动神经元中N/C比率明显高于对照组（图4A- 4F），这些结果表明C9-HRE-RNA和二肽重复蛋白DPRs均不通过隔离作用驱动eRF1的核积累。同样在ALS患者体内神经元的背景下，对死后皮质组织进行免疫组化（IHC），发现C9-ALS患者MNs中eRF1 N/C比率显著升高（图5A和5B），上述研究表明，部分eRF1在突变C9orf72患者神经元中重新分布。
图4 eRF1在C9-ALS-iPSC衍生MNs中重新分配
图5 eRF1在死后C9-ALS组织中重新分布
5、机制探究1：eRF1通过NMD介导C9-HRE表达细胞从蛋白质翻译到mRNA降解的转变
eRF1在调节终止蛋白质翻译和无义介导的mRNA降解(NMD)途径平衡方面具有重要作用，作者进一步探究eRF1再分配是否影响蛋白质翻译和NMD的状态。结果发现：C9-ALS患者运动神经元中蛋白质合成显著减少（图6A），但是在C9 MNs中eRF1基因沉默的作用更为温和，可能是因为翻译已经明显受损（图6C），证实了eRF1负责控制条件下的蛋白翻译。在C9-ALS患者中，含高pUPF1水平的运动神经元比例显著增加，表明无义介导的mRNA降解过度活跃，与蛋白质合成减少相反，并且eRF1基因沉默能显著降低pUPF1水平（图6D-H），表明无义介导mRNA降解的激活依赖于eRF1。
图6 C9-HRE细胞通过NMD影响蛋白质翻译和mRNA降解
6、机制探究2：C9orf72 mRNA被无义介导的mRNA靶向降解
进一步探究eRF1定位与C9-HRE RNA病灶的关系。结果发现有RNA病灶的C9-ALS患者运动神经元中eRF1 N/C比率明显高于无病灶的MNs （图7A）；eRF1基因敲减，降低了所有poly（A）RNA的N/C比，使之达到与对照MNs相同的水平（图7D和7E）， 表明eRF1在核内陷中的积累可能会降解或抑制扩增转录物的输出，C9-ALS MNs中RNA的核保留部分由NMD通路的eRF1依赖性诱导所介导的。进一步在果蝇杂交实验发现UPF1的减少显著增强了C9x30果蝇眼的退化，相反，在两种C9-HRE果蝇模型中UPF1过度表达显著改善了退化（图7G）。上述这些结果表明eRF1介导了C9orf72扩增转录本的UPF1依赖性降解。
图7 C9orf72 mRNA被NMD靶向降解
小编小结
首先，作者利用核质全蛋白质组分析证实重复扩增突变引起的定位改变与神经变性相关，C9orf72-ALS/FTD突变影响了RNA代谢和蛋白质翻译相关蛋白质的细胞定位。作者进一步在果蝇模型中证实eRF1和UPF1是C9-HRE体内毒性的调节因子。最后，作者在体内外模型中发现 eRF1在C9ALS神经元复杂核内陷中的积聚，引起C9-ALS神经元无义介导的mRNA降解过度活跃和翻译的减少；C9orf72-ALS/FTD突变也破坏了eRF1介导的NMD与翻译之间的平衡。本文揭示无义介导的mRNA降解途径及其调控元件可能是一种与ALS和FTD疾病广泛相关的治疗途径，为其未来个性化诊疗提供了新思路。
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