近年来，快速发展的寡聚核苷酸类药物开始作为小分子及治疗性蛋白药物的有力补充，成为全球创新药领域的热门方向。寡聚核苷酸类药物的研究、制造和质量控制需要使用高选择性、高灵敏度的LC-MS方法，科学家们通常采用多种离子对试剂和改性剂在负离子ESI-MS模式下进行反相色谱分析。
最近，基于BioAccord系统的寡聚核苷酸分析集成式LC-MS工作流程已成功搭建，这套紧凑、稳定且简便易用的平台，可用于寡聚核苷酸的各种常规分析，包括自动质谱去卷积、自动出具完整寡聚核苷酸质量数测定报告、合规环境下快速准确地进行纯度分析等，大大地提升了LC-MS分析方法的科学可靠性和质量放行的效率。
沃特世紧凑、稳定、简便易用的BioAccord系统
现在小编就向大家介绍这套以waters_connect HUB数据采集和处理软件控制的BioAccord系统，进行寡聚核苷酸分析的精简、合规工作流程。
更准确的去卷积质量数测定
在离子对反相色谱模式下，聚脱氧胸苷(polyT)寡聚核苷酸及其截断序列杂质在8分钟内即实现了出色分离。UV和TIC色谱图中均检出多种微量寡聚核苷酸杂质，这有助于根据相应的负离子模式ESI-MS谱图对所有截断的寡聚核苷酸物质进行指认。
图1：OST MassPREP样品中主要和次要组分的TUV和TIC图
OST MassPREP样品中确认共有26种寡聚核苷酸组分，所有谱图中的电荷态均呈双峰分布，且每种寡聚核苷酸的低电荷态（-3~-5）和高电荷态（-7~-15）均达到了各自的最大值。检出的所有电荷态谱图均呈双峰分布，这是寡聚核苷酸离子对反相分离的典型谱图特征，能够提供广泛的质量范围（m/z= 600~3000）以及数量相对较多的电荷态(6~12)便于去卷积。
图2：OST MassPREP样品中五种主要组分的ESI-MS谱图
ACQUITY RDa质谱检测器的高分辨率足以分辨高电荷态寡聚核苷酸离子的同位素，可以看到dT35寡聚核苷酸[M-12H]-12电荷态的单同位素峰明显区分。这种对各电荷态的同位素分辨率有助于BayesSpray去卷积算法在计算寡聚核苷酸的去卷积平均质量数时得出更加准确的测定结果。
图3：dT35寡聚核苷酸(10,585 Da MW)电荷态[M-12H]-12的详细视图，展示了m/z=880.6301处的单同位素峰信号
根据每种寡聚核苷酸组分的保留时间，在waters_connect中创建自动化数据处理方法，对UV色谱图中的26种寡聚核苷酸组分全部进行峰积分，计算每种寡聚核苷酸的丰度。此外，该处理方法还将BayesSpray去卷积算法用于采集自TIC谱图的同一组原始ESI-MS谱图，从而准确计算平均去卷积质量数。
更灵敏、准确的杂质分析
在分析的所有组分中，质量精度误差均低于15 ppm（不受丰度影响），26种组分测定结果的综合质量精度误差为5.3 ppm。
表1：MassPREP OST样品中鉴定出的26种寡聚核苷酸组分
即使将1 μM OST样品稀释100倍即上样量达100 fmol时，五种主要寡聚核苷酸也均能在UV和TIC色谱图中清楚检出，表明基于BioAccord系统，该方法的灵敏度足以检出微量寡聚核苷酸杂质。
图4：1 μM OST样品稀释100倍后的TUV和TIC图
使用BioAccord LC-MS系统分析每种寡聚核苷酸时，准确平均质量数测定结果的质量精度误差均低于15 ppm。这些结果清楚地表明了waters_connect工作流程能够对主要寡聚核苷酸及其杂质进行快速、准确的纯度分析以及完整质量数确认。
<案例一>
硫代磷酸化寡聚核苷酸分析
寡聚核苷酸类药物包含一段天然DNA/RNA序列，通常需要进行化学修饰以防止被天然存在的核酸酶降解。化学修饰主要有三种类型，包括骨架修饰、糖修饰和核酸碱基修饰。寡聚核苷酸类药物常使用骨架修饰和糖基修饰，但对于分子诊断用途的寡聚核苷酸，则首选核酸碱基修饰。
首先，骨架修饰是以硫原子取代磷酸骨架中的氧原子，从而得到硫代磷酸化(PPT)寡聚核苷酸。此类型分子需要使用独有的同位素模型进行多电荷去卷积以得到准确平均质量数。PPT寡聚核苷酸同位素模型考虑了硫同位素的天然丰度。
图5：25 mer全硫代磷酸化(PPT)寡聚核苷酸的TUV和TIC图
图6：25 mer PPT寡聚核苷酸的ESI-MS谱图
左右滑动查看更多
按照元素组成计算，该寡聚核苷酸的准确平均质量数为7,776.3314 Da。在waters_connect中使用BayesSpray和PPT寡聚核苷酸同位素模型对25 mer PPT寡聚核苷酸的ESI-MS谱图（图6）进行多电荷去卷积，然后将去卷积质量数与预测的准确平均质量数进行比较。
如waters_connect报告所示，表明去卷积质量数测定结果与MW计算结果仅相差1.5 ppm。显然，在使用PPT寡聚核苷酸同位素模型对硫代磷酸化寡聚核苷酸进行去卷积时，BioAccord系统能够测定准确质量数。
<案例二>
CRISPR领域常用的长寡聚核苷酸分析
图7：100 mer寡聚核苷酸的TUV和TIC图
图8：100 mer寡聚核苷酸的ESI-MS谱图
左右滑动查看更多
主要寡聚核苷酸在6.9 min时流出。按照元素组成计算，该100 mer寡聚核苷酸的平均质量数为30,907.7613 Da。
在waters_connect中使用BayesSpray多电荷去卷积算法对该寡聚核苷酸的ESI-MS谱图进行自动去卷积，实验测得的去卷积质量数与预期质量数相差26.9 ppm。可见即使用于长寡聚核苷酸（单体数>100的寡聚体），BioAccord系统仍然能够提供高准确度的质量数确认结果。
总结来说
✔ waters_connect工作流程能够对不同长度的寡聚核苷酸(10~35 mer)以及硫代磷酸化寡聚核苷酸进行高质量精度(5~15 ppm)的完整质量数确认。
✔ 该自动处理方法还能够为离子对反相色谱法分离的所有寡聚核苷酸样品组分提供纯度信息。
✔ 该套符合法规要求的自动化LC-MS工作流程可为寡聚核苷酸的快速质量数确认和纯度分析提供稳定且简便易用的解决方案。
想要获取更多实验细节？
感兴趣共同开发寡聚核苷酸相关应用？
感兴趣更多BioAccord应用案例？
相关文献
首页
