当前约有三分之一的癫痫患者属于难治性癫痫，且现有抗癫痫药物疗效并不显著，因此低碳水化合物高脂肪的生酮饮食（Ketogenic diet，KD）成为了有效的治疗方式，但患者难以坚持食谱及不良副作用限制了生酮疗法的应用。深入理解KD抗癫痫的分子机制对于开发临床有效的治疗手段大有裨益。目前研究发现肠道菌群能够调节多个可能与KD抗癫痫相关的代谢和神经通路。KD能够改变小鼠的肠道菌群，而当禁食导致肠道菌群缺乏时，小鼠表现出肝脏生酮作用受损。多项临床研究也已报道抗生素治疗可增加癫痫持续状态或症状性癫痫发作的风险，提示菌群和癫痫间的联系。基于上述已有的研究结果，加州大学洛杉矶分校Elaine Y. Hsiao研究团队提出了“肠道菌群可影响KD抗癫痫效果”的科学假说，并设计了一系列实验进行验证，相关成果发表于国际知名期刊《Cell》。
生酮饮食改变肠道菌群
采用6-HZ诱导建立难治性癫痫模型（多种抗癫痫药对该模型无效但KD有效），将SPF级小鼠分为KD组和正常饮食组（CD）。KD组癫痫发作阈值明显增高，血清葡萄糖水平降低，而血清β-羟基丁酸浓度增加（图1-A,B,C），且KD和CD组饮食摄入和体重没有明显差异。研究发现饮食干预4天后KD组菌群结构即发生明显改变，同时各时间点菌群α-多样性降低，但Akkermansia muciniphila（Akk菌），Parabacteroids（Pb菌），Sutterella，Erysipelotrichaceae显著增加，尤其是Akk丰度从2.8%±0.4%增加到36.3±2.8%（图1-D,E,F），而Allobaculum, Bifidobacterium和Desulfovibrio降低。以上结果表明KD饮食可以快速且大幅改变肠道菌群结构。
肠道菌群对于KD的抗癫痫效果的必需性
肠道菌群是否是KD的抗癫痫效果所必需的？研究者利用无菌小鼠和抗生素干预小鼠来测试KD抗癫痫效果。当菌群消失或紊乱后，KD的抗癫痫效果亦被消除，而当无菌小鼠在出生后填喂SPF小鼠肠道菌群后又可修复KD的效果（图2-A,C）。值得一提的是菌群介导的抗癫痫效果和血清β-羟基丁酸或葡萄糖水平无关。以上结果表明肠道菌群对KD的抗癫痫作用是必需的，且可能并不是通过改变β-羟基丁酸水平来实现。
为了寻找特定细菌参与KD抗癫痫作用，作者对抗生素干预小鼠填喂KD相关的细菌，再给予KD以测试特定细菌的抗癫痫效果。作者选取了KD中富集度最高的Akk菌和Pb菌，并将小鼠分为3组：Akk组（A. muciniphila），P组（P. merdae : P. distasonis=1:1，P菌中富集度最高的两个菌种）以及混合细菌组（A. muciniphila: P. merdae : P. distasonis=2:1:1）。持续14天后，这些菌均成为各自组内主要分布细菌。单独的KD可有效抗癫痫，而当抗生素处理后KD作用消失。混合菌种的填喂可恢复因抗生素处理失去的KD抗癫痫作用，但单独的Akk菌或Pb菌不起作用（图3-B），表明两种菌共同介导了KD的抗癫痫作用。进一步发现该作用由Akk菌和P. merdae共同介导，混合填喂Akk菌和P. distasonis则无效。CD组中富集的Bifidobacterium longum作为阴性对照同样没有效果。在无菌小鼠模型中，相比于单独的AKK或Pb菌，AKK菌和Pb菌的混合定植可促进KD的抗癫痫。以上结果表明KD所致的Akk和Pb菌的增加介导了抗癫痫作用。
KD型肠道菌群赋予CD小鼠癫痫抵抗作用
KD型菌群结构是否在CD小鼠中起作用？作者对抗生素处理的小鼠分别移植CD型和KD型肠道菌群，并都给予CD饲养。相比于CD饲养，移植CD型菌群小鼠后KD饲养癫痫阈值显著增加，这并不意外，更重要的是移植KD型菌群小鼠即使CD饲养也有同样的效果（图4-A）。表明即使在CD饲养条件下，KD型肠道菌群依然可以赋予小鼠癫痫抵抗。当菌群移植28天后，移植的KD型菌群完全转变为CD型菌群，癫痫的抵抗效果消失，提示KD型菌群、饮食以及神经元活动的持续交互是必需的。类似的，Akk和Pb菌富集效果在CD饲养的抗生素小鼠上显著优于单个菌种的富集（图4-B）。当然只用抗生素处理和无菌CD小鼠癫痫阈值的升高并不能保证这些结果的准确性。因此，作者重新在SPF级CD小鼠上测试了菌群处理的效果，与KD实验小鼠结果吻合，单独的Akk菌并无抗癫痫效果，而混合菌处理可显著增加癫痫阈值（图4-C）。停止给予菌群21天后，抗癫痫效果消失，提示持续的菌群干预是必要的。另外，只干预4天并没有观察到抗癫痫效果，表明长期的干预也同样是必要的。以上结果表明移植KD型菌群和长期的Akk和Pb菌处理可赋予CD小鼠癫痫抵抗。
KD型菌群可降低Kcna1-/-小鼠的阵挛性癫痫
为了验证6-Hz癫痫模型上的发现是否在其他模型上也同样存在，研究者采用Kcna1-/-小鼠模型进行相关研究，该模型可发生严重的反复自发性癫痫，且已有报道表明KD对其有效。Kcna1-/-小鼠经过抗生素或溶剂处理一周后，填喂溶剂或Akk+Pb菌，并给予KD或CD三周,结果和6-Hz模型上一致，KD显著增加了Akk和Pb菌的丰度（图5-A,B），且降低了癫痫的发生和持续时间（图5-D）。有趣的是相比于KD饲养的溶剂处理组，抗生素处理组显著增加了癫痫发作的次数和总发作时间，而定植Akk+Pb菌后可降低癫痫频率和时间至溶剂处理组的水平（图5-D）。综上表明肠道菌群可在不同癫痫类型小鼠模型中介导KD抗癫痫效果。
肠道菌群调节肠道、血清和脑代谢
基于上述发现，作者假设菌群代谢调节的某些代谢产物影响了癫痫易感性。作者利用代谢组学的方法分析了SPF CD、SPF KD、Abx SPF KD和Akk+Pb KD四组小鼠结肠内容物及血清的代谢组差异（图6-A）。结肠内容物和血清的代谢谱可区分癫痫抵抗和癫痫易感组，预测准确率分别达到94%和87.5%（图6-B）。在区分两组的关键代谢物时，作者发现生酮氨基酸-γ谷氨酰（GG）衍生物（GG-亮氨酸、GG-赖氨酸、GG-苏氨酸、GG-色氨酸、GG-酪氨酸）水平在癫痫抵抗组的肠道内容物和血清中普遍降低（图6-C,D）。相比其氨基酸原型，γ谷氨酰化的氨基酸倍受影响。这提示肠道菌群调控了宿主对KD的代谢响应，KD诱导的癫痫抵抗与菌群依赖的γ谷氨酰氨基酸水平改变有关。
脑依赖于必需氨基酸合成神经递质，因而对外周氨基酸的生物活性波动敏感。基于实验中发现的血清生酮氨基酸改变、氨基酸输入和脑GABA水平的关联以及GABA对于KD抗癫痫效果的理论，作者检测了海马（重要的癫痫传递区域）中GABA和谷氨酸的水平。同样的，海马代谢谱可明显区分癫痫抵抗组和癫痫易感组（图6-E）。GABA和谷氨酸水平在癫痫抵抗组增加，且GABA增加幅度更大。相比于CD组，KD组小鼠海马中GABA/glutamate ratios显著增加（图6-F），这种增加可被抗生素处理消除，但Akk+Pb菌的富集又可重新恢复。以上结果显示了海马GABA和谷氨酸水平受饮食和菌群依赖性调控。
细菌γ谷氨酰化途径影响癫痫易感性
γ谷氨酰转肽酶（GGT）催化谷胱甘肽获得γ谷氨酰基生成相应的γ谷氨酰氨基酸。既然在癫痫抵抗组γ谷氨酰氨基酸水平显著降低，那将CD小鼠γ谷氨酰转肽酶抑制后是否可以获得癫痫抵抗？作者使用该酶的抑制剂GGsTop处理SPF CD小鼠，发现小鼠癫痫阈值显著增加至SPF KD小鼠的水平（图7-A）。Kcna1-/-小鼠被处理后可显著降低癫痫平均持续时间。Akk+Pb菌富集KD小鼠补充生酮氨基酸后癫痫阈值显著降低至SPF CD组水平（图7-B），表明限制外周生酮氨基酸对于调控菌群和KD依赖的癫痫抵抗是必要的。
KD和Akk及Pb菌的互作是否能在体内影响GGT活性？作者发现相比于CD小鼠，KD小鼠粪便中的GGT活性显著降低（图7-C）。Akk+Pb菌富集的CD小鼠GGT活性同样降低，且Akk+Pb菌富集的KD小鼠GGT活性进一步下降。这些数据表明Akk+Pb菌可降低GGT活性，从而解释了癫痫抵抗组结肠内容物和血清γ谷氨酰氨基酸水平的降低。
作者又通过体外培养试验研究了Akk和Pb菌互作对GGT活性的影响。由于Akk不表达GGT，作者关注P. merdae(PbM)菌（GGT活性可被GGsTop消除）。当Akk菌被添加到CD型或KD型琼脂中，两种菌的生长都增强（图7-E,F），表明Akk菌可以释放促进PbM菌生长的因子，而PbM菌可反过来促进Akk菌生长。这种协同作用可解释KD小鼠两种菌（Akk和Pb）的内源性富集（图1 F）。有趣的是，当Akk菌被添加到CD或KD琼脂中，PbM的高GGT活性被消除（图7-G,H），这和KD小鼠两种菌富集后粪便GGT活性和γ谷氨酰氨基酸水平降低一致。PbM菌GGT活性的降低是否能够影响Akk菌的生长？作者重新设计了实验，在将两种菌共培养之前，先用GGsTop或溶剂处理P. merdae，结果表明GGsTop处理后Akk菌的生长显著增强。综上，Akk菌可代谢饮食中的成分维持P. merdae的生长，而这种交互降低了GGT活性。
小结
作者设计了系列研究性实验证实了生酮饮食可以改变肠道菌群结构，且肠道菌群对于KD的抗癫痫作用是必需的，特定的KD相关菌群可通过调节氨基酸的γ谷氨酰途径和海马中的GABA/谷氨酸的比例来实现抗癫痫效果。这项研究为后续研究肠道菌群在人类癫痫中的作用提供了依据，为寻找新的干预措施，改善癫痫发作严重程度和发病率带来了希望。
参考文献：
Olson C A , Vuong H E , Yano J M , et al. The Gut Microbiota Mediates the Anti-Seizure Effects of the Ketogenic Diet[J]. Cell, 2018, 173(7).
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