质谱的广泛使用使其开始进入QC实验室，今天小编将与大家分享Regeneron公司将质谱方法在QC放行环境下成功运行的案例[1]。
能够将大量的研究和开发方法转化成更加QC友好的能力，是很多公司正在面临的挑战。我所在部门QC分析科学部主要承担方法开发和转移，也负责一些工艺改进、自动化、新技术评估工作。我们花费很多时间尝试将新技术引入、评估不同的系统，也做新分子转移和测试。如果有方法转移过来, 我们负责将其打造得更加耐用以适应QC。我们要确保移交出去的方法是充分、耐用的，不想引起任何不当的失败或OOS(超出标准结果)、方法有效性问题。因为在放行环境下这些都将被监控，占用时间、耽搁放行。
- Regeneron公司QC分析科学部
Stacey Helming博士
运用实习生计划评估“质谱进QC实验室”能力
Stacey Helming博士团队的目标聚焦于持续改进提升实验室能力，不仅是把质谱放到QC环境中，并且要确保交付耐用性好的方法。由于较高的专业度要求，放到QC环境中的质谱数量受到限制，一方面仪器的故障排查难度大，另一方面单单是把方法本身做到耐用就已经很难了。Regeneron公司使用BioAccord系统最主要、也是贯穿始终的主题是提高效率。由于QC分析科学部人员短缺，他们依赖实习生计划帮助新技术评估环节。
图1. Regeneron公司的实习生计划
QC分析科学部有一个采用10个Assay放行的项目，包括典型的体积排阻色谱、微毛细管电泳（MCE）、肽图鉴别、对照品表征、电荷异质体分析（iCIEF或CEX）、GlycoWorks RapiFluor-MS试剂盒监控糖型、效价测定等，要检测的项目清单随分子不同而有所不同。
01
肽图分析自动化，10 min平台高效又耐用
典型的肽图流程将蛋白变性、酶解，然后反相分离肽，用紫外检测，作为鉴别方法非常好，但是由于生物药中大量的肽段，鉴定40-60个不同肽段，就需要在长达60-120 min运行方法以提高分离度、确认鉴定是否正确，而随着梯度变长，会导致峰形变差、后洗脱肽重复性变差等问题。
为了缩短时间，Stacey Helming博士团队彻底调整了肽图程序，消除了任何手动操作，脱盐结合孵育步骤，都转成在线进行。为了避免使用离子对试剂，他们采用表面带电颗粒色谱柱（CSH）减少峰拖尾，消除了峰拖尾意味着可以用甲酸替代TFA，指数式提高了灵敏度。有了这些武器助力，整个肽图方法被压缩到10 min。
图2. A)用肽图覆盖进行产品鉴定，
BioAccord系统综合运用了温和的源内裂解技术，针与针之间、每个运行程序之间，系统表现非常耐用，可以鉴定出各自的真正肽段，通过碎片匹配得到结构信息。耐用性的双重体现见图2。
02
强制降解研究，常见PTM都灵敏
实习生还评估了BioAccord是否对常见PTM都具有足够灵敏度。他们从查阅文献开始，两周内完成强制降解实验。从氧化来看，分子暴露在不同的双氧水条件下，鉴定出在这两个甲硫氨酸残基上的氧化。系统灵敏度足以观察到氧化比例的增加，第一个甲硫氨酸残基氧化大约4%，第二个甲硫氨酸残基氧化大约2%。
与典型的iCIEF放行方法相比，可以看到由于氧化，碱性峰相对主峰碎片的移动。使用BioAccord多属性流程显示良好的灵敏度和耐用性。脱酰胺数据显示相当好的桥接，团队还在挖掘更多与传统放行方法的对比。
03
糖化、糖基化、序列变体评估，微少组份都检到
关于糖化，是我们使用蔗糖等特定赋型剂替代葡萄糖，控制得很好的项目。很低浓度葡萄糖添加的改变即可获得这些肽段残基特异性糖化真正不同的相对丰度。BioAccord系统对低于0.2%比例的修饰都能够追踪到，甚至还找出些微肽段残基的不同。
糖基化确实对效价有影响，成为关键质量属性，无论是产品放行还是作为表征数据包的一部分都需要评估。Regeneron公司把很多糖基化分析纳入多属性工作流程中。
初步的数据显示，由于BioAccord系统的高灵敏度，在一个分子里0.2%序列变体、另一个分子0.5%的序列变体都能够被检测到。
图3. Regeneron 公司搭建的QC友好型自动化平台
持续获得成功
Stacey Helming博士总结到：
在多属性方法（MAM）里采用肽图流程，不仅用于鉴别，也用于对照品的表征，然后再取代电荷变异体和糖型的评估，从而整体提高效率。这个方法颇具潜力，持续收集到这些PTMs和属性，能够稳稳地、真正搞清楚你的产品，还能改善研究、规模放大和产品自身。
展望
FDA在2000-2015年间，审核通过了80个BLA的电子申请，其中有79个生物制品的申报材料中含有质谱数据，使用质谱进行的属性测定在逐年扩展。FDA审评员评论说：“我们预测将看到质谱技术在QC和可比性研究上的追加运用，LC-MS开启了从非法规依从性实验室渐进到受监管环境中的演变历程[3]。”
可见，监管机构对质谱在QC中的应用已有所考量。相信凭借质谱在生物药物研究与质控方面本身的优势、行业对先进技术和理念的开放态度，越来越多生物制药企业会着手准备，迎接质谱在QC中的应用新风向。
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参考文献：
1.Stacey Helming, Ph.D., Regeneron Pharmaceuticals, So, You Want to Put a Mass Spec in a QC-Release Laboratory, #ASMS2020.
2.Jeff Thompson, Ph.D., Regeneron Pharmaceuticals, Implementation RapiFluro-MS Kit and QDa Detector for N-Glycan Analysis in GMP Quality Control Labs, #ASMS2015.
3.Rogstad, S. et al., A Retrospective Evaluation of the Use of Mass Spectrometry in FDA Biologics License Applications, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2017, Vol 28, pp 786-794.
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