亲水作用（Hilic）色谱，有时被称为“含水正相色谱”，有时又被称为“反反相色谱”，简单来说，是极性的固定相和极性的流动相组成，参考表1，在固定相方面，看似和正相色谱一样，那么，同一款色谱柱是否既可以用于正相色谱，又可以用于Hilic色谱？在流动相方面，和反相色谱接近，那两种模式保留行为和流动相对保留的影响规律有什么差异？你对Hilic色谱是否也疑惑重重？接下来让我们一起揭开亲水作用 （Hilic）色谱的神秘面纱吧。
表1 反相、正相、Hilic色谱对比
一、
Hilic简介
1.1流动相
在大多数的Hilic分离中，采用的流动相为含有少量水/缓冲液与有机相混合（典型的是乙腈），水的比例为3%-40%之间。
水的比例不低于3%是由于Hilic色谱的保留机理决定的，普遍认为Hilic色谱流动相中的水会被吸附到极性固定相的表面形成水膜，然后分析物在水膜和流动相之间进行液液分配作用，加上极性官能团和固定相之间的氢键作用力，离子官能团之间的静电作用力等，实现被分析物的保留。水膜的作用非常重要，所以Hilic流动相中至少含有3%的水。当水的比例大于40%时，保留一般很弱（k≈0）。
1.2固定相
应用于Hilic色谱的固定相有：纯硅胶柱、氨基柱、二醇基柱、酰胺基柱等。纯硅胶柱有固定相不易流失的优点，在使用CAD、ELSD和LC-MS检测器时，最受欢迎；氨基柱，在Hilic色谱中的应用，特别适合碳水化合物（糖类）分离；二醇基柱，亲水性很好，可以提供不同的选择性。
二、
Hilic和正相色谱相比
2.1固定相的区别
同样是Silica，NH2，Diol柱，与用于正相色谱中的色谱柱不同，专为Hilic色谱设计的色谱柱，可以用于水/有机物的流动相中，换句话说，Hilic色谱对固定相的耐水性要求更高，否则会因固定相的水解，出现基线噪音大、色谱柱寿命短等问题。所以用于正相色谱中的色谱柱，不一定能用于Hilic色谱。而适用于Hilic色谱的色谱柱，可以用于正相色谱中。
典型案例：
Athena NH2-RP用于糖类分析，CAD检测时，能改善基线噪音。而国产A/C品牌、进口B品牌氨基柱由于键合相水解，基线噪音大大增加。
图1 几款氨基柱流失性对比
采用电喷雾检测器（CAD），考察了国产A/C品牌、进口B品牌氨基柱和安谱的CNW Athena NH2-RP在乙腈：水（70：30）的条件下的稳定性，结果表明，Athena NH2-RP的流失性更低，稳定性更好，是糖类分析的理想之选。
图2 Athena NH2-RP乳糖分析稳定性测试
Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）测试乳糖，连续进混合标准品，500针后，蔗糖和乳糖的拖尾因子和保留时间稳定，蔗糖的柱效基本保持不变，乳糖的柱效降低6%，Athena NH2-RP色谱柱在含水流动相中分析糖类物质具有优异的稳定性。
2.2应用范围的差异
正相色谱主要用于极性大的脂溶性化合物（图3），而Hilic色谱主要用于极性大的水溶性化合物（参考图2 Athena NH2-RP用于乳糖分析）。
图3 Athena silica硝基苯胺异构体分析
2.3总结
和正相色谱相比，用于Hilic色谱中的Silica/NH2/Diol等色谱柱耐水性更好，Athena NH2-RP在Hilic色谱糖类分析中表现优异。
对于极性强的化合物，如果在正己烷、异丙醇中溶解度较好，推荐用正相色谱，如果在水中溶解度较好，推荐用Hilic色谱。
三、
Hilic和反相色谱相比
3.1保留行为差异
极性较强的尿素，在Athena C18-WP (LAEQ-462572)没有保留，而在Athena NH2-RP (LAEQ-462568)可以很好的保留。和反相色谱相比，Hilic色谱对极性大的水溶性化合物保留能力更强。
3.2流动相中水的洗脱强度
以Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）对糖类物质的分析为例。
乙腈/水（75：25）
1.果糖 2.葡萄糖 3.蔗糖 4.麦芽糖
应用：蜂蜜 中国药典2020年版一部 P374
乙腈/水（70：30）
1.蔗糖 2.乳糖
应用：乳糖 中国药典2020年版四部 P690
对比蜂蜜和乳糖应用，采用同一支Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）色谱柱，流动相从乙腈/水（75：25）变为乙腈/水（70：30）后，蔗糖的出峰时间从14.008min缩短至8.840min，流动相中水相比例增加，目标化合物出峰变早。我们知道，反相色谱中，流动相中水相比例增加，目标化合物的出峰会变晚。在Hilic色谱中，流动相中的水相部分表现为强溶剂，这和传统的反相色谱完全相反。
3.3总结
对于极性大的亲水性化合物，在反相色谱中很难保留，可以用Hilic色谱增加保留。
在反相色谱中，流动相中的水相部分表现为弱溶剂，而在Hilic色谱中，水表现为强溶剂。
四、
Hilic色谱总结
Hilic色谱作为正相和反相色谱的补充，采用极性的固定相和流动相，在分析极性强的水溶性化合物中有很大优势。
通常情况，流动相中水相比例为3%-40%，水相比例太高，一方面目标化合物保留太弱，另一方面加快键合相的水解。
固定相的耐水解性要求更高，如Athena NH2-RP在Hilic色谱中特别适合糖类物质的分析，基线噪音小，色谱柱寿命长。
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