浅谈反相Flash色谱和正相分离的区别

Biotage

2020.12.18

作者拜泰齐

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反相快速纯化色谱以较低的成本和对环境的影响，实现了样品的高效分离纯化，影响了整个化学工业。反相Flash色谱在最近的十几年时间里形成了巨大的应用飞跃，但是，由于缺乏信息和数据的支持，化学家在很多情况下，都是靠经验进行纯化工作。

极性化合物、水溶性化合物得到了很多药物和天然产物研发机构的重视，这些分子是组成生物体的重要化合物。传统方法是用HPLC(高效液相色谱法)纯化制备此类化合物，但是成本较高。对于每天都要进行大量纯化工作的化学家来说，使用预装的反相快速纯化色谱柱是一种非常好的选择，可以处理各类极性化合物。

反相快速制备色谱不同于正相色谱，主要表现在三方面：

1) 固定相

2) 流动相

3) 适用的样品类型

固定相

正相硅胶具有极性基的表面；而反相硅胶是经过改性，表面键合烷基链（例如 C-18）,它的极性更小，因此，它对极性化合物有较小的保留。

经典的反相硅胶表面的图示。C-18的烷基链键合在硅胶表面，增加了硅胶的疏水性。

然而，由于长时间正相硅胶的强大的极性作用，经常会和样品形成死吸附，影响分离效果，科学家在硅胶是基础上进行了修饰，将C碳链连接到硅胶的羟基上使其极性降低，具有了脂溶性的特质，同时由于固定相基质的变化，之前在正相当中所使用的的溶剂变得不可用，需要使用水相和有机相混合体系进行洗脱，由于各类化合物在水相和有机相之间都有相应的分配系数，样品的分配系数不同，洗脱下来的速度就会形成差异，最终达到分离的目的。

目前市面上的反相Flash 固定相填料主要为C18，也有少部分的C4，C8等，如Bioatge 推出的专门针对于多肽大分子分离的多肽分子纯化色谱柱。

流动相

正相色谱，因为硅胶表面的硅羟基极性大，极性大的水溶性化合物很难被洗脱下来，只有使用更强极性的溶剂才能成功。因此在正相体系中，所使用的流动相都是极性比硅胶更大的溶剂，通过更大极性的溶剂将样品系统下来，从色谱原理的角度，这种通过极性大小，分子将吸附的相互作用的分离方式，我们称之为正相洗脱分离方式。

正相色谱，因为硅胶表面的硅羟基极性大，极性大的水溶性化合物很难被洗脱下来，只有使用更强极性的溶剂才能成功。在正相色谱条件下，可供选择的溶剂很少，因此，对极性大的水溶性化合物，很难得到足够纯度的产品。

然而，在反相色谱中，因为，极性化合物和固定相的吸附性较小，因此用较小极性的溶剂，就可以实现比较理想的洗脱效果。所以，在实践中，反相色谱可以提供更好的分离方法。固定相变化之后，其流动相也需要随之改变，反相的流动相往往是通过水相和有机相两种溶剂的混合，例如：水和甲醇、水和乙腈等，通过在水和有机相之间的分配系数的不同从而达到分离的目的。