前言：目前已有几种基于寡核苷酸的疗法获得了美国食品及药物管理局（FDA）的批准，但由于寡核苷酸的合成和降解途径复杂，涉及复杂的化学修饰，会产生数以百计的杂质，因此，使核酸的分离具有挑战性。而所有治疗用寡核苷酸在进入人体前都必须经过化学修饰，其中一种修饰是硫代磷酸酯（PS）修饰，这种修饰会产生非对映异构体：对于 20 核苷酸长的 PS 寡核苷酸，非对映异构体超过 50 万个。[1] 本文，我们介绍三乙胺乙酸如何助力治疗用寡核苷酸分析，尤其是在核酸定量分析和表征检测中如何发挥作用。
TEAA是什么？
三乙胺乙酸（ Triethylamine Acetate，TEAA ）是一种离子对试剂，本身是疏水性，同时又带正电荷，一方面，TEAA 的疏水基团又与固定相上碳 -18 链的疏水基团发生反应，另一方面，TEAA与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应。
而实现核酸分离是根据其碱基数目、构象、疏水性等特性，如，核酸中的磷酸基团带负电，RNA分子呈亲水性。像TEAA这种离子对试剂，起着连接核酸和柱基质之间的桥梁作用，使核酸吸附在固定相上面，然后，通过改变流动相中乙腈的浓度实现核酸的分离。换而言之，TEAA通过在核酸与柱基质的相互作用，从而分离核酸。
TEAA的应用场景
01
TEAA用于mRNA的HPLC的纯度和定量分析
在Europe PMC上报道了一项研究，用TEAA配制HPLC的缓冲液，纯化后，降低了mRNA的免疫反应，产生的mRNA不会诱导IFN和炎性细胞因子，并且，在原代细胞中的翻译水平提高了10 ~ 1,000倍。[2] 其中，缓冲液配制方法如下：
缓冲液 A 含 0.1 M 三乙胺乙酸 (TEAA)，pH = 7.0；
缓冲液 B 含 0.1 M 三乙胺乙酸，pH = 7.0 和 25% 乙腈。
可见，用TEAA配制的HPLC的缓冲液，降低了免疫反应，提高了mRNA的翻译效率，加速了mRNA从体外干细胞生成到体内基因治疗的研究进展。
02
TEAA用于mRNA Mapping 的LC-MS分析
在2022年Analytical Chemistry报道了一项研究，通过开发了一种自动化、高通量的工作流程，用于快速表征大RNA 和 mRNA 治疗药物并直接绘制序列图。其中，mRNA mapping分析中，将RNase T1消化后直接溶解在TEAA中。[3] 随后，使用TEAA配制的缓冲液，进行质谱分析：
缓冲液 A 由 pH 值为 7.0 的 100 mM 三乙胺乙酸（TEAA）组成；
缓冲液 B 由 pH 值为 7.0 的 0.1 M TEAA 组成，其中含有 25% 的乙腈
使用TEAA配制的缓冲液，在mRNA Mapping 的LC-MS分析后，获得了＞80% 的序列覆盖率的大 RNA 和 mRNA 治疗药物，在90分钟内即可完成，大大缩短了分析时间。
03
TEAA用于mRNA加帽加尾的LC/MS分析
在2022年Europe PMC上报道了一项研究，目的是开发一种流动相混合物，可以通过质谱法减少寡核苷酸的电荷态和加合物形成的数量，并使用这种流动相混合物来检测mRNA的加帽效率和polyA尾长。通过在流动相A中使用30mMHFIP, 10mm TEAA和1.2 mM TEA和乙醇的混合物，分析polyA尾长和加帽效率，而不需要在消化后进行额外的样品制备。[5]通过使用含有TEAA的流动相，无需在质谱分析前对样品进行脱盐处理，大大减少了样品制备时间和分析所需的 RNA 量。[4]
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近年来， 随着越来越多的文献报道，TEAA凭借其独特的离子对性质，不仅可用于核酸HPLC的纯度和定量分析，而且在核酸的LC/MS分析上也发挥重要作用，相信未来，TEAA在核酸分离上会有越来越多的应用被科研工作者发现。
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参考文献：
[1] Torgny Fornstedt, Martin Enmark,Separation of therapeutic oligonucleotides using ion-pair reversed-phase chromatography based on fundamental separation science,Journal of Chromatography Open,Volume 3,2023,100079,ISSN 2772-3917,
https://doi.org/10.1016/j.jcoa.2023.100079.
(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2772391723000038)
[2] Karikó K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Research. 2011 Nov;39(21):e142. DOI: 10.1093/nar/gkr695. PMID: 21890902; PMCID: PMC3241667.
[3] Vanhinsbergh CJ, Criscuolo A, Sutton JN, Murphy K, Williamson AJK, Cook K, Dickman MJ. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics Using Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 May 24;94(20):7339-7349. doi: 10.1021/acs.analchem.2c00765. Epub 2022 May 12. PMID: 35549087; PMCID: PMC9134182.
[4] Strezsak SR, Pimentel AJ, Hill IT, Beuning PJ, Skizim NJ. Novel Mobile Phase to Control Charge States and Metal Adducts in the LC/MS for mRNA Characterization Assays. ACS Omega. 2022 Jul;7(26):22181-22191. DOI: 10.1021/acsomega.2c00185. PMID: 35811888; PMCID: PMC9260895.
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