与研究miRNA本身的性质相比，更多研究者希望揭示miRNA的功能。miRNA功能的研究占miRNA研究领域中的绝大部分，并且已经形成了一条通用的研究路线：
■ 根据文献查阅或高通量预实验，选择感兴趣的miRNA研究对象
■ 通过生物信息学预测该miRNA的靶基因，通过Western等实验对靶基因进行验证
■ 通过蛋白质功能分析，在靶基因的基础上研究目的miRNA的功能。并进行in vivo验证
随着研究的不断深入，越来越多miRNA的功能通过以上的研究路线被发掘，随之而来的就是按照上述路线按部就班的完成实验发文章越来越困难。其实，这种研究路线针对的是miRNA的靶基因、即miRNA的下游通路，而miRNA的上游研究则相对较少。
以前，以miRNA序列及mRNA的3''UTR序列进行靶点预测的工具很多，但对于miRNA的启动子等了解甚少，可用的数据库也不多。随着技术的不断进步，配合NGS的不断发展，目前研究miRNA的上游调控因子，可参考的资料越来越多，该领域也越来越受到研究者的重视，是很好的课题切入点，值得我们关注。
引文
在今年7月的Cancer Research杂志上，Bolta等人证明miR-192在胰腺癌中被下调，从而促进了癌症的发展。他们首先通过高通量筛选的方法找到了13条miRNA，满足a：在胰腺导管腺癌（PDAC）和慢性胰腺炎（CP）中的表达量显著异于正常组（NP）；b：在上游10 kb内包含CpG岛。其中，他们发现miR-192在PDAC和CP组中表达量显著降低，并且其上游3.5 kb处的CpG岛会超甲基化。于是他们推测，这个位点是miR-192的转录启动子，其超甲基化会导致miR-192转录水平的下调。他们用抑制甲基化的药物及双荧光素酶报告等实验验证了这种推测。后续，他们又用证明PAI-1是miR-192的靶点，PAI-1会诱导诱发上皮-间充质转化（EMT），从而阐明了miR-192对胰腺癌的抑制通路。他们也用动物体内实验证明了他们的设想。（Bolta et al., Cancer Res., 76(14); 1–11 (2016).）
解析
综合来看这篇文章，对于miR-192的下游靶基因验证及功能研究，作者采用了常规的实验思路和实验流程，其实验结论和实验设计并无太多过人之处。但是，本文建立并证明了miR-192的上游调控途径，围绕miR-192的上游调控来串联整体实验思路，从而使文章的分数大大提升（IF=8.5）。miRNA上游的实验设计并不复杂，操作也比较简单，绝大多数分子生物学实验室都能完成。当前研究背景下，将同样的工作量投入到miRNA上游研究，会比投入下游研究得到更高的回报。所以，当感觉miRNA的下游靶点研究过于常规，亮点难寻时，可以关注miRNA上游的调控通路，达到事半功倍的效果。
综合近期文献的特点，汇总目前常见的miRNA上游研究的思路如下：
1. 通过在线工具预测miRNA的启动子，常用网站如DIANA-miRGen v3.0、PROmiRNA、Promoter 2.0 Prediction、Promoter Scan等。
2. 通过双荧光素酶等实验验证启动子。
3. 通过在线工具预测启动子附近的转录因子结合情况或甲基化的情况，预测miRNA转录的影响因素。常用的预测网站如TRANSFAC、Mapper、TRED、Consite等。
4. 通过IP/双荧光素酶检测/突变及敲除等实验验证这些因素对miRNA的影响力。
5. 证明这种对miRNA的调控具有何种生物学作用。配合下游靶点验证实验更佳。
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