蛋白质反相液相色谱方法开发中离液剂添加剂的相关数学模型研究

零·序言

之前我们翻译过多篇Merck公司利用ACD/AutoChrom在制备分离及二维液相色谱上小分子目标物分离分析方法的研究成果。近期，Merck团队在《Journal of Chromatography B》上发表了一篇ACD/AutoChrom软件在蛋白质及多肽领域方法建模的应用，主要研究了不同buffer下的温度模型及buffer种类对梯度温度模型质量的影响。以下是对Merck公司发表文章的翻译。

生物医学的最新进展使得基于蛋白质和肽为基础的药物疗法显著增加，这些药物和疫苗通常含有对其疗效至关重要的高级结构。色谱和光谱技术的连用是生物药物分析、纯化和化学表征的关键技术，在制药行业，小分子的计算机辅助色谱建模已经达到了成熟阶段，但基于软件的方法优化对大分子还没有看到同样水平的应用，主要是因为生物大分子在色谱条件下的存在复杂构象变化。为了规避这些挑战，我们利用计算机辅助建模技术研究了使用不同的离液剂(三氟乙酸、高氯酸钠和盐酸胍)对模型的影响。利用ACD/Labs软件分别采用线性和多项式回归模型考察了梯度斜率、柱温和流动相缓冲液对8种不同蛋白模型(全转铁蛋白、细胞色素C、脱细胞肌红蛋白、核糖核酸酶A、核糖核酸酶AI-A型、白蛋白、y-球蛋白和甲状腺球蛋白)的影响。通过在流动相中使用强离液和变性改性剂，实验输出和建模输出之间的相关性得到了显着改善，即使使用线性回归建模（如小分子通常观察到的）也是如此。相反，在低柱温下使用传统的 TFA缓冲液需要使用多项式回归建模，以阐明蛋白质在色谱条件下的潜在构象结构变化。通过此次研究，Merck团队展示了现代计算机辅助色谱建模技术在开发基于蛋白质的RPLC检测方法中的强大功能。

先采用细胞色素C作为研究对象，考察了TFA体系下温度模型。色谱参数：

Phase A: 0.1% TFA

Phase B: 乙腈

流速：0.5mL/min

色谱柱：HaloC4 (2.1 mm × 75 mm, 2.7 µm particles)

梯度：10-70%(B%，20min)

分别在7个不同的温度条件下进行实验，具体的柱温为20,30,40,50, 60,70和80℃。分别采用线性函数和二次多项式对lnK及1/T拟合，构建出温度模型。以细胞色素C在不同温度下的保留时间为横坐标，模型预测的保留时间为纵坐标绘制出二维图，以考察不同数学模型下的模型预测的准确性。

从下图可以看出，采用二次多项式构建的温度模型中实测保留时间与预测的保留时间有更好的对应性，线性相关系数R²=0.9971。而采用线性函数构建的数学模型预测保留时间与实际保留时间之间存在不同程度的偏差。

当在流动相体系中添加更强的离液剂如高氯酸钠或者蛋白变性剂盐酸胍时，则表现出不一样的现象。图2显示了在含有三种不同改性剂（TFA、GuHCl和NaClO4）的流动相中细胞色素C蛋白质的保留时间和温度之间关系。这个例子强调了保留温度关系对所用流动相性质的依赖性。正如图 1数据所预期的那样，当使用TFA时，蛋白质的保留时间作为温度的函数遵循二级多项式关系。

图2.不同流动相下细胞色素C保留时间对温度的依赖性

有趣的是，当应用一阶多项式回归模型时，使用基于GuHCl 和NaClO4的改性剂获得的数据显示出很强的线性相关性(R2 >0.99)。众所周知，TFA通过几种机制改善蛋白质分离，包括离子对相互作用及弱的离液效应。强的离液剂(如NaClO4和KPF6)可以破坏蛋白质高阶结构中的氢键，这可能导致蛋白质变性(展开)，并消除(或显著减少)梯度色谱条件下的蛋白质构象结构变化。同样，通过在流动相中添加GuHCl蛋白变性剂，通过简单的一级拟合(通常对小分子进行)，可以增强预测和实验tR值之间的相关性。

为了进一步验证通过细胞色素C实验得到的结论，Merck团队又选取了分子量从12-670kaD，疏水性差异性大8种不同蛋白分子进行研究，包括全转铁蛋白、细胞色素C、脱细胞肌红蛋白、核糖核酸酶A、核糖核酸酶AI-A型、白蛋白、y-球蛋白和甲状腺球蛋白。

分别在TFA，NaClO4和GuHCl体系下设计了梯度温度2因素正交实验以考察2D模型的质量。其中，选取了7个温度实验点(20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃和80℃)和3个梯度实验(10-70%B%, tG分别为10min，20min和30min)，共21针实验。

采用一阶多项式构建2D模型，实验统计结果如图3a所示。图中绿色，黄色和红色分别对应1%，3%和5%的保留时间误差。从图中可以看出，其他蛋白的结果与细胞色素C的结论基本一致。基于这些结果，我们可以得出结论，离液剂的强度对于建立保留和温度之间的关系至关重要。在此，使用强离液剂如 NaClO4/ HClO4（在酸性pH值下）可提供更强的保留与温度的函数关系。

图3b,3c表示的是在NaClO4模型中，梯度参数为10-70%B%，30度的条件下，可以满足所有蛋白质的基线分离并且预测保留时间误差均在1%以内。

由于蛋白质在色谱条件下构象的变化，蛋白质RPLC方法优化确实比小分子的蛋白质更复杂。尽管有许多因素可能导致蛋白质变性(有机流动相、添加剂、压力、温度)，但在色谱条件下可以识别出温度依赖性的构象变化。GuHCl常被用来消除蛋白质的二级结构，从而改变蛋白质的温度保留模型，使其类似于小分子。通过实验进一步证实，蛋白质构象的变化导致了实验中观察到的特殊温度保留模型，并随变性剂的强度而变化。我们发现，随着变性剂强度的增加，tR与温度的线性关系更加明显。我们可以利用这一结论，以一种简单的方式来简化这种复杂分子的建模。

基于蛋白质的药物色谱方法开发可能非常复杂，需要克服许多挑战，包括无处不在的复杂高阶结构。尽管拥有多种强大的色谱工具，当前的生物制药工具箱仍然需要结合新的计算机辅助保留建模的方法。基于小分子的软件建模技术相对成熟；然而，大分子的保留时间建模目前是一个相对不成熟的话题。生物分子在色谱条件下的构象变化显然是一个具有挑战性的因素，对于开发具有耐用性的分析方法至关重要。