生物药蛋白产物的表征

蛋白质是由不同氨基酸连接形成的多聚体，并且通过正确折叠为一个特定构型，发挥蛋白药物的生物学功能。氨基酸序列的特定位置可以与化学基团共价结合，发生蛋白质翻译后修饰，这些翻译后修饰会导致蛋白的结构发生改变，从而影响蛋白药物的生物学活性，所以需要对蛋白的分子量、肽段覆盖率、翻译后修饰等进行检测。

高分辨质谱目前是进行蛋白结构表征的最广泛，也是最重要的工具。丹纳赫生命科学拥有高分辨质谱，结合成熟的前处理流程和强大分析功能的软件，可以完成蛋白的各种结构表征。

分子量的检测是鉴定蛋白的第一步，使用高分辨率质谱分析可得到蛋白质的多电荷信号，通过对信号进行去卷积分析，可获得精确分子量数值，并初步判断蛋白的修饰状态。对于抗体药物还可打开轻重链或者去除糖基，分别分析糖基化和去糖基化轻链和重链的分子量。

单抗的分子量图谱

肽段覆盖率是指检测到的肽段氨基酸数量占该蛋白质总氨基酸数量的比例。蛋白质肽段覆盖率的检测，对于蛋白质类药物的一级氨基酸序列的确证，保证蛋白质类药物的高级结构形成及维持蛋白质类药物性质均具有很重要的意义。

将样品通过酶切，进入质谱采集肽段的一级质谱信息和二级碎片离子质谱信息。采用软件对总离子流图进行分析，将测得肽段的相对分子量与理论值进行比较，并且通过二级质谱离子确认多肽的序列正确性。根据已确认肽段的氨基酸序列与理论序列的比值计算肽图覆盖率。

肽图图谱

软件对肽图的分析结果

通过丰富的碎片离子信息，可以识别翻译后修饰发生的位点。

脱酰胺形式的图谱

二硫键是蛋白质通过各种链间和链内的半胱氨酸连接在一起的化学键，对蛋白质分子保持正确的高级结构，维持必要的生物活性至关重要。所以在蛋白质类药物的结构分析中，二硫键一直是分析的重点。

错配二硫键连接肽段信息、二级离子匹配信息

通过相关软件不仅可以确认理论连接二硫键，还能检索错配二硫键，最终结果能同时呈现以上两种二硫键连接肽段。

N糖（聚糖与天冬酰胺的氮链相连）是生物药物中，尤其是单抗药物中最广为人知的糖基化形式，其中N-聚糖结构会影响药代动力学、药效学和免疫原性，因此需要对糖型进行分析。丹纳赫生命科学可向用户提供两种解决方案对N糖糖型进行分析。一种是利用糖苷酶将糖链切下，经过荧光素 2-AB（对氨基苯甲酰胺）标记后，采用旗下SCIEX的高分辨质谱进行检测，通过软件中的CHO表达体系中常见的236种N糖糖型，对样品中的糖型进行解析。由于重组蛋白中的N糖糖型比较复杂，匹配全面的数据库，适合用质谱进行解析。

重组蛋白糖基总离子流图

糖库

另外，丹纳赫生命科学还有毛细管电泳方法快速对N糖糖型进行分离分析。采用磁珠结合样本，用糖苷酶将糖链切下，用APTS进行标记，样品洗脱下来后进入毛细管电泳进行分离检测，软件内置糖型数据库，可对结果进行快速分析，整个过程只需65分钟，前处理1个小时，分离分析5分钟，方便快捷。

毛细管电泳糖型分析前处理

毛细管电泳糖型分析结果

使用SCIEX毛细管电泳进行快速糖型分析，还可搭配自动化高通量前处理的方案，可以跟Beckman Coulter的自动化工作站进行整合，同时进行96个样本的糖型检测前处理，结果稳定，重复性好，主要糖型峰面积的RSD小于3%。毛细管电泳的方法适合进行单抗N-糖的糖型分析。

毛细管电泳自动化工作站整合方案

除了常规的蛋白结构表征方案外，丹纳赫生命科学还可提供更加深入的蛋白表征分析，如O-糖糖型分析，高分辨质谱利用电子活化解离（EAD）模式，鉴定氨基酸同分异构体，岩藻糖基化N-糖的定位和确认等。

同分异构体的鉴定

声明：欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载或引用本网版权所有内容须获得授权, 转载时须注明「来源：SCIEX」。申请授权转载请在该文章下“写留言"。