衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)是分析生物流体的一种理想技术。红外光谱记录分子键振动,可以获得生物样品的红外指纹图谱。医疗保健研究人员和临床医生关注“液体活检”(一种微创的样本收集方法)。许多生物液体,如尿液、唾液和血液,可以使用ATR-FTIR进行研究。利用生物液体样品之间的光谱差异,可以区分健康患者和患病患者。
血液是医学诊断中应用最广泛的生物液体,它由血浆、红细胞、白细胞和血小板组成。对于光谱分析,通常使用血浆或血清,因为这两种液体可以冷冻保存。血液的冷冻过程会导致细胞破坏,血红蛋白对光谱信号影响很大。血浆是在抗凝管中离心分离的水溶液,而血清是通过血液凝固分离血细胞和血小板得到的,如图1。血清更常用,因为血清的制备方法可以有效地去除红细胞。
图1 血浆和血清
ATR-FTIR技术在中红外区域(4000cm-1~400cm-1)检测生物样品(如蛋白质、脂质和氨基酸)中功能基团的基本振动,仅需要几微升的小样本量,即可提供快速的结果;同时也是一种节约成本、易于使用的诊断方法。ATR-FTIR技术进行血清分析已用于许多疾病研究,如癌症、子宫内膜异位症、脑部疾病和病毒感染1~6。
水对生物液体测试的影响
ATR-FTIR技术在进行生物液体样品分析时,水会对红外光谱的产生影响,图2。水的极性很强,会产生强烈的红外响应;当使用ATR-FTIR分析生物流体样品时,水的红外光谱掩盖了样品中的生物信息。通常,在检测生物液体时,测试者必须等待样品干燥;这很耗时,并延长了总测试时间。更快的方法是使用加热ATR附件。通过加热样品,水分蒸发得更快,总测试时间显著减少。本文使用加热ATR附件的IR5红外光谱仪,去除水分并快速测量血清样本的光谱。
图2 红外光谱中的水峰
实验设备及方法
图3 IR5傅里叶变换红外光谱仪(a)和ATR加热附件(b)
为了验证加热ATR附件对干燥时间的影响,将3μL样品移液到ATR上,不加热ATR采集光谱。ATR预热并保持在50℃恒定,重复此过程。红外光谱的分辨率设置为4cm-1,扫描10次,每个光谱的总测试时间为35秒。
结果与讨论
图4 人类血清白蛋白的ATR-FTIR光谱图
(蓝色:室温下干燥2分钟;红色:加热至50℃干燥)
ATR-FTIR提供了生物液体样品中生物成分的重要信息,图5给出了血清样本光谱的波段分布。红外生物光谱分布在两个区域:从2600cm-1到3800cm-1的高波数区域,以及由双键拉伸和指纹区组成的2000cm-1到500cm-1的低波数区域。低波数区域提供具鉴别性的数据,也是最常用于诊断的区域7。
图5 人类血清白蛋白的红外光谱波段分布
结论
本文通过血清样本的生物指纹图谱测试,表明IR5对生物液体分析的高灵敏度。IR5傅里叶变换红外光谱仪配备加热ATR附件,克服了样品含水的问题。使用加热ATR附件,在不降低光谱质量的情况下,使光谱采集所需的干燥时间大大缩短。
参考文献
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