漫谈全二维气相色谱方法优化（二）

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上次跟大家聊的是在全二维谱图中怎么看分离好不好。今天谈谈全二维的分离原理和具体分离过程。

我们不妨把自己想象成样品中的一个组分分子，在热调制全二维色谱中进行分离的过程。 

进样后，我们进入了一维柱，随着柱箱温度的上升，我们顺着载气在一维柱慢慢地往前移动，周围的温度从低到高，明显感觉移动的速度越来越快，直到走完了整根柱子，刚出了一维柱，我们就进到了一个很冷的地方，移动速度瞬间变得很慢甚至完全停了下来，而且我们这个组分的队伍分散了开来，最前面的队友们已经不知去向，后面的队伍还一直往我们这边聚集（同一物质在调制器中被切割成几个切片）；过了几秒钟，一股高温热流通过，我们被快速释放往前冲了过去，刚刚冲了一小段距离，突然，周五又变得很冷，我们又一次停了下来，还没等我们反应过来，一股比刚刚更猛烈的热流涌过来，我们被迅速地赶到了二维柱（两极调制过程，能有效避免温度变换过程中引起的穿透），二维柱很短，没过几秒钟就走完了，这段时间内周围的温度甚至都没怎么变化，我们就到了检测器，并留下了一个信号。

——来自一个样品组分分子的自述

总体来说，这是个很复杂的过程，但是我们分开看，主要考虑影响分离的因素。第一部分一维柱的分离跟我们知道的常规一维色谱并无区别，分离过程和优化方法也基本一致；上一次我们说了，我们的主要任务是如何提高二维上的分离效果（但不意味着一维的分离不重要，后面会谈到）。那我们看第二维，对于某个组分来说，第二维的分离可认为是一个恒温的快速分离过程（因为时间很短，整个二维保留时间内温度没有太大变化），我们主要来说这个。

具体来说，在恒温分离过程中，主要的参数是色谱柱规格，流速和温度。不同的色谱固定相对不同化合物的分离效果不同，另外，第二维的色谱柱固定相肯定跟第一维有差异。

差异越大越能体现正交分离，二维分离效果更好，但二维分离太好要求调制周期越长，对一维分离造成破坏，这也可能是个问题，所以，选择第二维柱子并不是要和第一维差异越大越好。

在不考虑补气条件下，二维的流速和一维一样，相对于温度，载气流速的优化限制更大（存在最佳流量区间，而且需要考虑到质谱的承受能力），一般来说我们会选择一维分离的最佳流速，同时确保对质谱的兼容性。

现在主要讨论温度的影响，这个温度指的是某组分在二维分离时所处的温度，差不多等于它从一维柱流出进入二维柱时柱箱的温度（假设二维柱和一维柱在同一个柱箱内，调制过程的时间可以忽略），而这由一维柱上的保留时间和柱箱的升温速率决定。

某组分在二维分离时的温度 = 其在一维上的保留时间 x 升温速率

一维的保留时间和升温速率决定了这个组分在二维上的分离效果！！！

看，现在一维和二维已经紧密的耦合起来了。我们不能把全二维色谱当成两个独立的分离过程来考虑。

那什么影响了一维的保留时间呢？一维柱规格（包括柱长，固定相，膜厚），流速，升温速率。

这儿又出现了这个升温速率。说明这个参数非常关键，而且在优化过程中，这个参数修改起来又非常方便（不需要拆换柱子，直接在软件上设置就行），所以在实践中，我们都喜欢通过改变升温速率来完成优化过程。

我们具体举个例子说说升温速率的影响。

如果我们在上一次分析的基础上，提高升温速率，每个组分在一维的保留时间会减小，但综合起来的效果会导致其在二维分离时的温度升高，这样每个周期内不同物质的在二维上产生压缩，二维分离效果变差。反过来，如果降低升温速率，一维保留时间延长，但综合效果是其在二维分离时的温度降低，从而使二维分离效果提高，每个周期内不同物质被拉开。

通过调整升温速率，我们可以实现对二维上各个组分的拉伸或者压缩，最优的效果是同一周期内的峰尽量分开，但避免峰迂回（wrap-around）现象。

峰迂回是指二维分离时间超过调制周期，导致下一个周期的组分跟前一个周期混在一起出峰的情况。

当然，升温速率不变的情况下，如果改变一维柱的规格（长度，内径，膜厚等），而产生的保留时间变化，也会达到同样的效果。比如，用一根60m的一维柱，相比30m的同等规格的一维柱，其他条件都不变，二维的分离会变差（留给大家思考下原因），此时如果要达到同样的二维分离效果，在不改变二维柱的情况下，需要减小升温速率才能抵消影响。或者，延长二维柱长度或增加二维膜厚，提高二维分离能力进行补偿。

最后，特别要指出，在全二维分析优化中，一维分离、二维分离、和总体分析时间这三者的平衡是非常微妙的。

延长一维柱长可以使一维分的更开，但同时会在二维产生压缩，导致二维分离变差；而二维柱增加后，二维分离变好，同时要求更长的调制周期，这样反过来又破坏一维的分离效果（过长的调制周期会导致原来一维分开的物质又在调制器重新混合，从而影响一维分离效果，所以一般会选择“正好”的调制周期）。也就是说，在总体分析时间恒定的情况下，如果你极力提高二维分离，就会损害一维分离；而为了提高一维分辨率，就必须牺牲二维的分离。当然，降低升温速率可以同时提高一维和二维分离效果（见上），所以只要组分的二维分离不超过调制周期，我们一般会倾向于较慢的升温速率（太慢的升温速率会造成调制周期过大，从而又损害一维分离效果），但这会导致总体分析时间增加。如果想加快分析时间，就需要提高升温速率，这样一维和二维峰分离效果都会下降。所以，很多时候需要根据样品的情况和具体分析需求，再综合考虑一维和二维的分离效果进行优化并最终确定分析方法。

如果你在全二维色谱分析中没有太多经验，我们总结了一些全二维方法优化的有用规律，以及常用柱系统的推荐方法，下次再聊。

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