一、简介
一种快速、可靠、经济的高通量筛选方法，在药物发现的早期进行抗增殖和毒理学评价，具有很高的吸引力。传统的方法评估细胞存活率和增殖利用比色读数，如 MTT assay1 。随着时间的推移，“ 一种溶液 ”测定方法已经发展起来，基于 MTS (5- ( 3- 羧基甲氧基苯基 )- 2- ( 4,5 - 二甲基噻唑 )-3- ( 4- 磺苯基 ) 四唑 )，MTT 的类似物，可产生紫色水溶性 formazans 作为细胞活力指标。一些“ 一种溶液 ”测定 ( 细胞毒性测定 - ab112118 ) 使用一种专有的水溶性染料，在细胞还原时改变其吸收光谱，以达到更高的灵敏度和稳定性。
虽然应用广泛，但以吸光度为基础的比色法细胞毒性测定也有共同的局限性。它们对环境条件 ( 如孵育时间和温度 ) 很敏感，只提供终点读数，更重要的是，它们是依赖于细胞代谢检测试剂的破坏性方法。为了在大量的细胞中筛选大量的潜在化合物，需要一个快速、经济、可靠的系统，这将大大加快药理学研究。
CloneSelect Imager ( CSI ) 专业地应对了这些挑战。它以极快的数据采集速度在一系列微孔板上捕获整个孔的图像 ( 整 个 96 孔板 90 秒 )。然后，可以将获取的数据导出为 Excel 电子表格以供进一步分析，也可以将其可视化地显示为一系列饼图。通过自动细胞检测和孔汇合度判定算法，CSI 提供了对每个孔中细胞增殖的无标记、非侵入性和直接的实时分析，并可以在多个时间点监测细胞生长。
优 势
1
使用无标记、无创成像仪评估活细胞增殖
2
通过减少检测试剂降低成本
3
通过去除数据收集所需的采样或移液步骤来减少误差
4
通过消除检测试剂和孵育时间，将总检测时间降低到 90 秒以下
通过对传统比色法细胞毒性测定和基于 CSI 图像的、无标记的细胞毒性测定 ( 图 1 ) 的工作流比较，CSI 测定通过消除检测试剂的使用和孵育时间，将总测定时间从 141 分钟减少到不到 2 分钟。此外，本研究还证实了 CSI 在抗癌药物的细胞毒性和抗增殖活性评价中的应用。
人单核细胞 U937 细胞系，一个稳健的细胞模型2 ，高通量筛选用于 3 种抗癌药物 :5- 氟尿嘧啶 (5-Fu) 3 、顺铂和奥沙利铂4 的细胞毒性评估。结果表明， CloneSelect Imager 提供了一种快速、可靠和低成本的选择，以确定不同的抗癌药物对人非贴壁白血病细胞系 U937 的细胞毒性。
二、材料和方法
材料
• 试 剂 盒 1 : CellTiter 96 AQueous 一 种溶液细胞增殖方法 ( Promega cat.# G3580 )
• 试剂盒 2 : 细胞毒性检测试剂盒 ( Abcam cat.# ab112118 )
• 人单核细胞 U937 细胞系 ( ATCC cat. #CRL-1593.2 )
• 5- 氟尿嘧啶 ( Millipore Sigma cat. #F6627 )
• 顺铂 ( Millipore Sigma cat. #232120 )
• 奥沙利铂 ( Millipore Sigma cat. #O9512 )
• Corning 96 孔微孔板 ( Corning cat. #3300 )
细胞铺板
为了验证每种方法准确检测大范围活细胞的能力，U937 细胞被放置在 Corning 96 孔微孔板中，每孔 312 至 10,000 个细胞。每个板的第一列只含培养基 ( 不含细胞 )，设为空白对照， 用于数据分析。实验前，将未处理的细胞置于 37℃ , 5% CO2 条件下沉淀生长 24 小时。
细胞增殖和细胞毒性实验
U937 细胞以 5000 细胞/孔的密度接种于 Corning96 孔微孔板中，并使其生长于 37℃ ，5% CO2，24h。在孔间空隙中加入 100-150 μL 的细胞培养水，以最大限度地减少培养基蒸发，保证孔间和区域间的均匀热分布。第二天，首先使用 CloneSelect Imager 对孔板进行监测，以生成 day0 孔的汇合度数据，然后在三个重复的孔中添加不同浓度的化合物， 5- 氟尿嘧啶为 256.2 μM 至 0.039 μM ，顺铂和奥沙利铂为 167 μM 至 8.47 nM。用 CSI 在不同时间点 ( 第 1、2 天 ) 反复测量未处理细胞 ( 对照 ) 和处理细胞的微孔板，以监测细胞生长， 并放回培养箱。在第 3 天，为了获得同一时间点同一微孔板的细胞毒性数据，首先使用成像仪扫描同一微孔板，然后每孔加入 30 μL 试剂盒 1 或试剂盒 2 的“ 一种溶液 ”。将微孔板置于 37℃ 孵育 2 小时。使用 SpectraMax ABS Plus 微板读卡器，吸光度 ( 光密度 OD ) 检测试剂盒 1 在 490 nm 读取，试剂盒 2 在 570 nm / 605 nm 读取。
图 1 传统的基于比色法吸光度的细胞毒性测定和基于克隆选择成像 ( CSI ) 图像的无标签的工作流程比较。* 每个样品的估计试剂成本由本研究中使用的试剂盒 1 和试剂盒 2 的价格计算。
统计分析
用 CloneSelect Imager assay 或比色法测定获得的所有数据都通过减去无细胞对照孔的值进行含有细胞孔的背景校正。药物处理对细胞的影响计算公式为 : 细胞活力 (%) = 100 X 样本/对照。为了评估用 CSI 测定的药物效果，分析孔汇合度以计算相对细胞活力，在测定结束时使用未处理的细胞 ( 对照 ) 作为 100% 活细胞：相对细胞活力 (%) = 100X 样品/对照。EC50 值由 SoftMax Pro 7.1 软件 ( Molecular Devices ) 使用非线性回归 4- 参数确定对数曲线拟合。EC50 是产生 50% 最大细胞反应的药物浓度。
三、结果
CSI 测定和比色测定的结果具有直接可比性，因为在通过 CloneSelect Imager 成像后立即使用比色试剂盒测定具有不同细胞密度的相同孔。在图 2 中，数据绘制为吸光度 ( 检测试剂盒 ) 或孔汇合度 ( CSI 检测 ) 的背景校正值与每孔细胞数的关系。CSI 测定和比色测定均可轻松测量细胞在 96 孔板中，每孔密度从 10,000 到低至 312 个细胞。
图 3 显示了药物 ( 5-FU ) 与 U937 细胞以九种不同浓度孵育 72 小时的剂量反应曲线。CSI 测定 ( 绿色图 ) 的剂量反应曲线与另外两个比色细胞毒性测定 ( 测定试剂盒 #1 和 #2 ) 的剂量 - 反应曲线一致。使用 SoftMax Pro 软件中的剂量反应 4- 参数曲线拟合绘制所有数据。软件计算出类似的 EC50 值，分别为 2.2 μM ( 蓝色图， Assay kit #2 )、3.0 μM ( 绿色图，CSI 检测 ) 和 4.7 μM ( 红色图，Assay kit #1 )。
图 2 接种 24 小时后各种未经处理的 U937 细胞的检测比较。使用 SoftMax Pro 软件中的二次曲线拟合绘制吸光度 ( 测定试剂盒 ) 或孔汇合度 ( CSI 系统 ) 与每孔细胞数的平均值。红色图，检测试剂盒 #1，(r2 = 1.000)；蓝色图，检测试剂盒 #2(r2 = 1.000)；绿色图，CSI 检测 (r2 = 0.999)。
图 3 用 5- 氟尿嘧啶处理 72 小时的 U937 细胞的剂量反应图比较。所有图通过未处理的细胞与化合物浓度归一化，都显示了细胞活力或相对细胞活力。使用 SoftMax Pro 软件中的剂量反应 4- 参数曲线拟合绘制数据。红色图，检测试剂盒 #1；蓝色图，检测试剂盒 #2；绿色图，CSI 测定。
另外两种铂类抗癌药物顺铂和奥沙利铂以与 5- 氟尿嘧啶相同的方式进行了测试。在图 4 中，CSI 提供了一个直观的热图，其中包含饼图和显示两种铂药物在与细胞孵育 72 小时后显示的不同细胞毒性活性的值。细胞用相同浓度的顺铂和奥沙利铂处理的结果表明，奥沙利铂在 U927 细胞中比顺铂更具细胞毒性，这与其他癌细胞系中的发现一致。这一结果也得到了在 CSI 测定后立即对相同样品进行的两次比色测定 ( 测定试剂盒 #1 和测定试剂盒 #2 ) 的证实 ( 表 1 )。CSI 测定 ( 表 1 )， 显示奥沙利铂具有较低的 EC50 值，表明较高的细胞毒性。通过 CSI 测定获得的三种抗癌药物化合物的 EC50 值与通过传统比色细胞毒性测定获得的值在 1-2 微摩尔范围内。
图 4 用顺铂 ( 从 A 到 D 的行 ) 或奥沙利铂 ( 从 E 到 H 的行 ) 处理 72 小时的 U937 细胞的孔汇合度百分比。化合物浓度从第 3 列增加到第 12 列 ( 从 左 到 右：8.47 nM、25.4 nM、76.2 nM、0.229 μM、0.686 μM、2.06 μM、6.17 μM、18.5 μM、55.6 μM 和 167 μM )。
表 1 使用非贴壁的 U937 细胞与三种抗癌化合物药物孵育 72 h 后获得的 EC50 (μM) 值。
结论
在本研究中，在量化三种抗癌药物化合物对 U937 细胞的细胞毒性作用时，将 CloneSelect Imager 检测与两种广泛使用的基于比色吸光度的细胞毒性检测进行了比较。所有三种测定都产生了非常相似的 EC50 结果。然而，CSI 检测提供了一种无标记的直接通过使用即时全孔细胞成像和孔汇合度测定获得这些初步数据，在不到两分钟的时间内评估药物对细胞的影响，零试剂成本、零孵育时间和零手动样品处理时间。此外，CSI 检测允许用户在多个时间点重复收集数据，而无需采样或任何干预药物治疗或正在进行的功能检测。这种无标签，非侵入性在早期新化合物筛选和药物开发过程中为用户节省了时间和成本。所有这些功能使 CloneSelect Imager 成为药物筛选和药理学研究中传统比色细胞毒性测定的有吸引力的替代方案。
参考文献：
1. Mosmann T: Rapid Colorimetric Assay For Cellular Growth And Survival- Application To Proliferation And Cyto-Toxicity Assays. J Immunol Methods 1983, 65(1– 2):55–63.
2. Liu G, Chen S, Hu A, et al. The Establishment and Validation of the Human U937 Cell Line as a Cellular Model to Screen Immunomodulatory Agents Regulating Cytokine Release Induced by Influenza Virus Infection. Virol Sin. 2019 Dec;34(6):648–661.
3. Ghoshal, K., and Jacob, S. T., An alternative molecular mechanism of ac tion of 5 -f luorouracil, a potent anticancer drug. Biochem. Pharmacol., 53(11), 1569– 1575 (1997).
4. Marqués-Gallego, P., den Dulk, H., Backendorf, C. et al. Accurate non-invasive image-based cytotoxicity assays for cultured cells. BMC Biotechnol 10, 43 (2010).
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