目前全球已有9款CAR T细胞治疗产品上市用于治疗B细胞肿瘤。不同于传统药物，CAR T在静脉注射给药后会分布到各个器官包括肿瘤组织，循环浓度在短时间内下降，随后CAR与肿瘤靶点结合，CAR T细胞被激活并增殖，循环CAR T细胞往往在给药2周达到峰值，之后根据个体差异呈现不同程度的下降趋势，有的个体会长期监测到一定水平的CAR T细胞，并且与长期缓解有关。因此监测CAR T细胞在外周血循环药代动力学（Pharmacokinetics，PK）对于临床预后的判断至关重要。
目前实验室常用的方法有ddPCR, qPCR以及流式细胞术（FCM）等，ddPCR和qPCR均是在转基因水平监测CAR的拷贝数，而在医院等实验室很难获得厂家的scfv序列，因此很难进行监测。而FCM是目前实验室最常用的检测手段之一，不管是科研单位还是医院流式细胞仪都是必需的的检测仪器，因此利用FCM方法来监测CAR T细胞的PK是最简便且快速的方法，且同时可以进行免疫分型以及T细胞功能的检测。
这篇文章中，华中科技大学同济医院的科学家以CD19 CAR为例，验证商业化抗体Rabbit anti-mouse FMC63单抗R19M 检测CAR19 T细胞的特异性、最低检测限LOD、最低定量限LLOQ以及精密度，同时通过大量临床样品验证了FCM和ddPCR方法学的相关性和一致性（准确度），具体信息已在表1和图1中详细阐明。
CAR T细胞药代动力学的一般规律：FDA推荐推荐CAR T细胞相关PK参数包括：达峰浓度（C max）；达峰时间（T max）；部分药时曲线下面积（pAUC）；最后观测浓度（C last）；C last时间以及半衰期（t 1/2）；
表1. 验证设计方案以及数据统计评估
图1. 整体验证方案的工作流程图
01
特异性
本研究中，对比了三种CAR检测抗体protein L、CD19抗原蛋白以及抗CAR抗体R19M在外周血样本中的特异性，通过图2结果表明protein L的特异性较抗原蛋白和R19M抗体差，而重组抗原蛋白存在不稳定性，因此本研究选择特异性和稳定性较好的R19M进行CAR T药代动力学的检测。
图2. Agilent NovoCyte流式细胞仪进行圈门策略以及抗体特异性验证
02
灵敏度
流式方法分析的灵敏度包括最低检测限LOD也就是指信号值与背景值得区分能力，本研究中根据 15 份不含 CAR19 T 细胞的 外周血样本的 FCM 检测结果计算出 LOD（即平均值加三倍 SD 值）。最终检测出平均值为0.016%，而SD为0.00696%，因此LOD最终为0.03678%（图2B）。
基于LOD值，利用wild-type 293FT细胞梯度稀释阳性对照细胞293FT-CAR19，将CAR阳性比例的最低理论值设置在0.05%。根据图3结果，7个稀释梯度的检测值与理论值线性相关R2=0.9999。且在最低稀释比例组中，9个样品的平均检测值为0.048%，intra-CV为10.8%，inter-CV为2.0%。结果表明，当采集足够多的细胞时，通过R19M 抗体流式检测 CAR19 阳性细胞的的 LLOQ 设为 0.05% 是安全的。
图3.Agilent NovoCyte流式细胞仪进行梯度稀释293FT-CAR19细胞的线性检测结果
03
准确度
本研究中通过ddPCR的方法来验证准确度，并在两种来源的阳性样品（293FT-CAR19细胞系和188份CAR19 T细胞治疗后的临床外周血样本）上进行了FCM和ddPCR的并排检测。根据检测结果分析CAR T/Lym 和 copies/μg DNA的相关性，在阳性细胞系上的结果表明二者的斯皮尔曼相关系数为1（图4A），呈完全相关。而在临床样本数据中，188个样本的相关系数为0.6875呈强相关。
研究者发现在CAR T/Lym<0.5%的样品中，FCM和ddPCR数据呈弱相关（r=0.3577）。当只分析CAR T/Lym>=0.5%的样品，发现相关系数增加到了0.814，呈极强相关性。这些数据共同表明在临床检测中，ddPCR 和 FCM 在监测 CAR19 T 细胞药代动力学方面具有相对较好的一致性，同步证明了FCM作为临床上CAR T细胞PK检测方法的准确性。
图4. FCM和ddPCR检测结果的相关性研究结果
04
精密度
使用 CAR19 阳性的 293FT 细胞系通过梯度稀释制备了标准样本。每个样本在三个独立实验中进行处理和检测，每个实验有三个重复，并测定FCM和ddPCR两种方法的 inter-CV和 intra-CV值。结果显示所有结果中CV均不超过18%，表明两种方法都能精确定量CAR19阳性细胞。然而发现两种方法的CV在CAR19丰度下降时均会升高，表明两种方法在定量低表达丰度的CAR19时精密度都会下降。
图5. FCM和ddPCR的精密度对比研究结果
05
总结
应用 FCM 是检测和定量体内CAR19 T 细胞的一种可靠的方法，它与 ddPCR 具有良好的一致性。在检测 CAR T 细胞丰度较低的样本时，ddPCR 和 FCM 的精确度都有所下降，导致两种技术的一致性降低。因此，同时采用ddPCR 和 FCM 两种方法检测 CAR T 细胞可为体内 CAR T 细胞动力学提供更可靠的结果。
而本研究中FCM采用的是安捷伦Novocyte系列智能化流式细胞仪，Novocyte系列流式细胞仪配备顶级的核心硬件，保证仪器的性能与灵敏度。可提供多达 5 个激光器和最多 30 个独立检测器，多达 30 个荧光通道的灵活选择。软件设置中英文界面，并做到采集与分析为一体，同时内置多种数据分析模块。搭配自动化上样系统NovoSampler Q，可集成到不同的实验室自动化平台中，满足流式管、不同规格EP管以及多种微孔板等，能够实现无人值守自动化采集功能。Novocyte系列流式细胞仪一直以来以其卓越的性能、高灵敏度以及操作简便而深受客户的喜爱。
参考文献
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3. Sarikonda, G., Mathieu, M., Natalia, M., Pahuja, A., Xue, Q., Pierog, P. L., Trampont, P. C., Decman, V., Reynolds, S., Hanafi, L. A., Sun, Y. S., Eck, S., Hedrick, M. N., Stewart, J. J., Tangri, S., Litwin, V., & Dakappagari, N. (2021). Best practices for the development, analytical validation and clinical implementation of flow cytometric methods for chimeric antigen receptor T cell analyses. Cytometry. Part B, Clinical cytometry, 100(1), 79–91. https://doi.org/10.1002/cyto.b.21985
4. Dasyam N, George P, Weinkove R. Chimeric antigen receptor T-cell therapies: Optimising the dose. Br J Clin Pharmacol. 2020 Sep;86(9):1678-1689. doi: 10.1111/bcp.14281. Epub 2020 Mar 24.
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