CRISPR-Cas9是一项革新性的生物技术:使用基因组DNA切割酶Cas9和单分子向导RNA (sgRNA) 形成复合物 (RNP),识别DNA上特定的碱基序列,进行精准剪切甚至修复。该技术在基因治疗药物、农作物的基因改变以及诊断试剂等多个领域的应用研究正在不断推进中。
近日,在《Analytical Chemistry》期刊上发表的一篇文献中,作者等研究人员利用超高性能尺寸排阻色谱和多种检测器分析CRISPR/Cas9、sgRNA及其复合物,发现各成分中存在多聚体。
另外,研究中还使用阴离子交换色谱分析切割的DNA片段,对CRISPR/Cas9中的酶活性进行了评价。结果发现多聚体会影响复合物的形成,降低酶活性。由此可知,色谱分析对CRISPR-Cas、sgRNA等的基因编辑所用试剂的质量评价有效。
Ref.: J. Camperi et al., Anal. Chem. 2022, 94, 2, 1432–1440, CC BY NC ND
研究人员使用了UP-SEC色谱柱TSKgel UP-SW3000对CRISPR/Cas9、sgRNA及其复合物进行了UP-SEC分析。在各成分及其复合物 (分子量约180 kDa) 中发现了多聚体,特别是在sgRNA (约100碱基) 中发现存在大量二聚体、三聚体和四聚体。可以看出这些多聚体对CRISPR/Cas9的复合物形成以及DNA剪切活性有影响。
图1 UP-SEC色谱叠加图
研究人员在分析sgRNA的多聚体时,串联2支TSKgel UP-SW3000色谱柱进行更细致的分析。结果发现对sgRNA进行70℃的热处理时多聚体会消失,几乎变为单体,在CRISPR/Cas9的复合物中,多聚体也会减少。
随后,使用无孔填料的阴离子交换色谱柱对剪切后的2个DNA片段进行定量分析时还发现,如果使用热处理后的sgRNA,CRISPR/Cas9的DNA剪切活性也会提高。
图2 文献汇总数据的模式图
使用UP-SEC色谱柱可对CRISPR/Cas9和sgRNA的多聚体等物理特性进行高分辨率分析。另外还发现,可以通过使用阴离子交换色谱分析DNA片段,来评价CRISPR/Cas9的DNA剪切活性。由此可知,在医疗领域的应用中,对基因编辑试剂CRISPR/Cas9和sgRNA的质量管理、酶活性的评价中,UP-SEC和AEC是非常有效的分析手段。
另外,关于蛋白、肽、核酸分析表征中TSKgel SEC色谱柱的选择及应用实例,也可参考往期推文:→→ 蛋白质及核酸分析用SEC色谱柱的选择。