以下内容是ACD公司的AQbD系列课程的第四章色谱柱相关知识的文字稿。此文字稿内容并非是课程内容的录音，内容可能存在一定的差异。为了提高可阅读性，将原ppt的图片和文字的内容也做了必要的调整。
本文的内容由ACD/Labs的技术工程师李丹以及中国区经理阎作伟准备，由阎作伟来进行讲述。
本文内容包含四部分。首先介绍了色谱柱评估实验的方法，讨论色谱柱作用能力以及选择性能力评估的方法学；然后对不同种类的一些色谱柱的选择特性和保留特性进行了分析和说明；第三部分单独对混合模式色谱柱的进行了介绍，对其中的一些案例进行了解析；最后一部分是讲了一个小故事，色谱柱被离子对试剂改性后，基于其上开发出来的方法的生命周期结束以及迅速重新开发的方法。
在如上图所示的色谱柱里，当溶质进入到色谱柱后，流动相携带着溶质运动。溶剂峰由于和色谱填料没有发生什么作用，因此它最先出峰。而溶质分子由于结构的不同，其保留能力也各不相同，因此依次出峰。
先贤Snyder先生提出了以上的疏水减法模型来表示反相色谱里物质的保留的诸多种作用力。第一种作用力示第一张图来表示为疏水作用。溶质分子结构的疏水性如果较强，就会与脂溶性固定相之间产生疏水作用力。由于相似相溶，疏水性强的物质倾向于在色谱填料上停留更久。第二张图提示了虽然化合物的体积也会影响保留行为，圆圆的胖胖的分子相对于瘦瘦长长的分子来说，它不容易进入到色谱柱的空腔深处，因此其保留就会弱一些。第三和第四张图分别表示了氢键的酸性和碱性。如果溶质分子上的某个氢原子和一个电负性强而半径又比较小的原子共价相连，氢原子能够因此提供一个空轨道。这种氢原子如果能够和色谱柱上某处能够提供孤对电子且半径小的原子相互靠近时，便会形成部分电荷的互相吸引，这种弱相互作用叫做氢键。相比完整正负电荷的吸引而言，作用力大小的确要弱很多。色谱柱上存在大量的硅醇基，硅醇基的氢也能够提供空轨道，而溶质分子上的原子如果携带孤对电子的话，两者靠近也能够形成氢键。显然形成氢键可以增大溶质的保留。第五张图是第二行的第一个，这是一个典型的离子作用的图示，如果溶质分子带上了正电，而恰好硅醇基带上了负电，则两者之间会有静电作用力发生，这种作用力的大小比氢键强的多。第六张图则显示了是分子的电荷偏移时，原子会带上部分电荷，这个部分电荷同样也有可能和带电的硅醇基发生互相的吸引或者排斥。硅醇基不是随时都带电的，它也有自己的pKa，通常这个pKa是在5-7之间，因此在中性和碱性条件下硅醇基上会带有负电荷，但在酸性条件下，尤其是强酸性下，这种带负电荷比例就非常的低。第七张图显示的是氰基柱和有电荷偏移的溶质之间的部分电荷互相吸引增大保留的情况，氰基自身具有比较强的偶极矩。第八张图则显示了苯基柱增大保留的原理，派电子云之间的互相吸引。
由于色谱柱的基质材料，填料类型和制作工艺各不相同，因此很多看起来可能类似的色谱柱会对同样的物质有明显不同保留行为。比如用ODS-3色谱柱和SB-C18色谱柱来保留溶质分子时，如果选取不带任何氢键和电离基团的中性分子，则这些物质的保留因子呈现出明显的规则的线性关系。但对于含有氢键和碱性电离基团的分子来说，其保留因子就明显落在了线性之外，而且都落在了偏向于SB-C18一侧，也就是说对于这些物质来说，SB-C18上相对有更强的保留。
因此在2013年时，Eureby等人选取了用田中柱效测试的实验方法，选择了其中的一部分，用一些简单易得的标准物进行谱柱的能力标定。以期对以上的这些主要的作用力能有一个定量的能力描述。
实验方法并不复杂，使用四个实验就能够完成。整个方法有3个水相，1个有机相，所以如果有一套柱筛选系统，完全可以买入这些标准物对色谱柱的性能进行快速的标定和计算。
这些参数包括疏水的保留能力，疏水选择性，体积选择性，氢键的能力，pH7.6下的离子交换能力，pH2.7下的离子交换能力。有了这些属性，就可以进行色谱柱能力的两两比对，基于某些特定的能力挑选色谱柱，从众多色谱柱中挑选出差异性大又具有代表性的色谱柱来进行筛选工作。ACD的色谱柱工具Column Selector 数据都是来自于这个标准方法，数据来自于Eureby在英国的实验室。如果诸位AutoChrom用户对Column Selector有数据增补的要求，应向我提供目标色谱柱的名称列表。
第一个测量的参数是中性化合物戊苯PB的保留因子，获得测试色谱柱的疏水保留能力。戊苯PB的logP=4.9，没有可电离基团，其保留能力来自于分子与固定相的疏水作用。
戊苯的保留因子，用保留时间来进行换算（tR-t0）/t0。数值越大，色谱柱的疏水保留能力就越强。刚才提到过，疏水保留能力，疏水选择性以及体积选择性是用一个实验条件完成，走一个70%的甲醇等度，因此上图可以看到Hypersil ODS色谱柱跑出的色谱柱色谱图里有多个标准物。
将Zorbax SB-C18和 Inertsil ODS3 色谱柱进行保留能力的比对时，可以发现同为C18色谱柱，ODS3的数值略大。这和填料的比表面积的大小以及碳载量的多少相关。
以安捷伦的SB系列的色谱柱进行比较，C18色谱柱的kPB为6左右，C8色谱柱的kPB为2左右，苯基色谱柱的kPB为1左右，氰基柱的kPB为0.36。假设t0为1分钟，则C18上的保留时间为7分钟，C8上为3分钟，苯基柱上为2分钟，氰基柱上的保留时间不到1.5分钟。从这个表格的比较值来总结，随着固定相的疏水性降低，PB的保留能力在降低，也就是疏水保留能力在降低。
第二个测量的参数是疏水选择性，这个选择性自然是用两个物质的保留因子相除而来的。选用的标准物是刚才用到的戊苯以及比戊苯少一个亚甲基的丁苯。
差了一个亚甲基，这两个物质之间的疏水性会发生较大的差别。PB的保留显然强于BB，选择性是两者之间的保留因子的比值。
这两个物质的比值肯定的大于1，比值越大，说明疏水性区分能力越强。当然这两个物质的体积上也有差异，但是这个差异被忽略了，因为脂肪链上的亚甲基的多与少对体积的影响相对于下面要提到的体积的影响要小很多了。
比较SB-C18和ODS-3 ,会发现两者之间的差异很小。也即是说虽然ODS-3在碳载量或者比表面积上略微优胜，其保留时间更长，但其疏水选择性上并不优胜。
继续比较Agilent SB系列的色谱柱，可以发现疏水选择性有明显的趋势，也就是随着固定相的疏水性的下降，色谱柱的疏水选择能力也在下降。
第三个测量的参数是体积效应，选取的化合物是两个结构很类似的多环芳香性化合物，它们分别是苯并菲(T)和邻三联苯（O）。
这两个化合物的疏水性是很接近的，但体积有明显的区别。因为前者是平面结构，形态扁平，后者是个立体状态，体积大的多。如果色谱柱在体积上有较好的选择性，则会让扁平的分子进入到固定相构成的狭槽，增加其保留。如果色谱柱没有体积选择性，则两者的保留不会有差异，因而共流出。
由于前三个指标都是用的70%的甲醇等度，因此可以用4个标志物一个实验测得这三个指标。
比较SB-C18和ODS-3,ODS-3 的数值优胜，似乎原因是和它更大一点的比表面积有关。
而再去查看SB系列色谱柱的体积选择性，其结果差异性就很大了。的确很难总结出规律，但所有的数值都是大于1的，并没有小于1的情况发生。
接下来讨论氢键的能力。注意这里面讲的是能力，而不是选择性，因为在这个实验里，标准物苯酚实际上是一个参考基准，测它和另外一个标准物，在这里是咖啡因分子，实际上结构不相似，而且结构差异很大，疏水性差异也很大。
咖啡因不电离，由于含有很多杂原子因此疏水性低，其结构中有3个氢键的孤对电子供体，而苯酚只有一个。此时用咖啡因的k除以苯酚的k，由于疏水性差异很大，通过常识会知道这会是一个小于1的数值，如果这个数值越接近于1，说明色谱柱的氢键能力在弥补了色谱柱的疏水作用力，增大了咖啡因的保留。如果这个这个数值大于1，说明咖啡因的保留强于了苯酚的保留，那会相当有趣。
SB-C18同ODS-3相比，SB-C18的能力就更强一些，主要原因猜测是SB C18不封端，拥有更多能提供氢键作用的硅醇基。
从Zorbax SB系列的色谱柱上来看有非常戏剧化的结果，的确发生了大于1的情况。也就是说C8,苯基以及氰基都能将咖啡因的保留增大到苯酚之后，苯基柱增大的尤其多。的确，越短的固定相，带来的位阻就越小，咖啡因这种扁平的分子就容易进入固定相的狭槽内和硅醇基产生氢键作用。而在苯基柱上还有派键的额外的增大保留的效果，因为相对苯酚的苯环来说，咖啡因能够提供更大的派电子云。
最后来测量一下离子交换能力。测离子交换能力使用的标准物是苄胺和苯酚，显然苯酚还是扮演着提供基准坐标的作用，如果离子交换能力强，则将苄胺的保留时间增大向苯酚靠拢，用苄胺的保留因子除以苯酚的保留因子这个数值就会相对大一些。
可以看到Hypurity C18色谱柱在pH2.7和7.6的条件下，在碱性条件下硅醇基的离子交换能力体现出来，会增大碱性化合物的保留。而苯酚在pH7.6下的保留为何会减弱呢？主要原因是硅醇基带了负电荷之后，其氢键能力就消失了，苯酚本身是中性的但有形成氢键的基团-酚羟基，丧失了与酚羟基形成氢键的机会，保留因此而减弱了。
因此在7.6和2.7下获得两个标准物的保留因子的比值为0.29和0.10。
看一下这个案例，比较Hypersil ODS以及HyPURITY C18两根色谱柱，使用了80等度的甲醇来运行，目测两者的疏水选择性相当，HyPURITY C18的空间选择性更强。
两根色谱柱比较，在体积选择性方面HyPURITY C18 色谱柱更强。两者的疏水选择性是相当的。
另外一个例子来自于Ascentis RP-Amide 和Ascentis C18色谱柱，测试方法是70%甲醇等度。从图上来看前者的四个标准物和后者的标准物的出峰顺序不一致。比较而言前者的体积选择性更好，后者的立体选择性更好。
AutoChrom自带的分析方法数据库里的数据结果也同样证实了这一点。
当对众多的色谱柱进行标定之后，我们可以进行色谱柱的两两比较，也可以按照某个特定的能力进行色谱柱的搜索，比如搜索离子交换能力特别强或者特别弱的色谱柱。离子交换能力弱，说明封端性能好，硅醇基裸露的少，这样对于碱性化合物在中性条件下的峰形会比较友好。碱性化合物在强酸性条件下完全电离，峰形变差的原因是超载，并不是硅醇基的离子交换作用造成的。
对以上知识的另外一个应用是对色谱柱进行差异性的选择，用于色谱柱的筛选阶段的选型。在对有关物质的结构和保留性能进行logD-pH的评估，研究对象有部分pH下有保留风险，而部分pH下没有保留风险，则在保留无风险的区域内可以进行全面的筛选活动。如果分析对象的整体保留风险都很大，则应考虑非常规的色谱体系进行筛选，比如Hilic体系。如果分析对象个别保留风险大则可以选定一些有特殊保留能力的色谱柱进行研究。以上这段内容，我们可以在本系列的第八节再举例讨论。
对于有代表性的色谱柱的差异化的选择，可以通过基于色谱柱6参数的聚类分析来完成。
从上图聚类分析的结果来看，基本上其分类效果与基于填料种类的色谱柱分类原则很接近。最大的一组是C18类的色谱柱，第二组里有C8以及ACE的C18-PFP和C18-AR，猜测这一组有比较强的氢键效应，第三组是苯基，第四组是氰基柱。至于是否是每组里去挑一根色谱柱进行第一轮筛选，还是由于顾虑氰基柱的保留能力弱而踢掉它重新聚类分析，这个由科学家自己来判定利弊，没有标准的答案。
接下来，我们来找一些有意思的色谱柱的分离或者保留的案例来进行讨论来学习不同的色谱柱会有什么样的特点。
这是多孔硅胶上键合固定相和封端的的简单示意图。
现在的色谱柱的填料以及工艺过程的进步，色谱柱的多样性可以说是百花齐放。
首先我们对安捷伦的市场上常见的C18色谱柱进行一次选择性的比较和评估。这四种色谱柱各有特色，因此对同一组化合物的保留和分离能力来说就有所不同。
选取一些抗生素，用千分之一的甲酸和乙腈为A,B流动相，走一个0-95%的梯度，筛选结果互有优劣，但趋势上来看后三者的结果很类似，它们的保留行为差异体现在个别色谱峰对的分离度上。而CS-C18的保留行为就特别，这9个化合物有7个保留因子显著降低，有两个保留因子显著增高。显著降低的7个化合物中5，6号化合物的降低幅度要小于另外5个（1-4，7）。
从结构上来分析，化合物1-7都带有正电荷，8-9带有负电荷，因CS C18的硅胶表面被正电荷修饰，则对1-7产生斥力，对8-9产生引力，因此分别体现出保留因子的减小和增大。在化合物1-7中，化合物5，6的电离性弱，因此被排斥的比较小，其他5个化合物含有仲胺和叔胺，电离性强，因此保留因子减小的很快。8，9号化合物带有负电，因此会被增大保留。因此CS C18在疏水作用之外是有较强离子交换作用的，在分析1-9号化合物的时候分离度很好，但是保留因子显著减小和增大，对第一个峰的保留和准确定量以及最后一个峰决定的运行时长都不利。因此就像使用所有混合模式色谱柱要注意的问题一样，对CS C18的使用一定要对目标物的带电情况有所认知才能有的放矢。
再来分析一下安捷伦的极性修饰的色谱柱分析以下的化合物。
A相为万分之五的甲酸而B相为乙腈，走一个5-90%的15分钟梯度。根据pH-logD在pH2.8附近2，3号化合物的logD很接近。
2,3号化合物的先后关系在不同的极性修饰的色谱柱上有不同的表现。两者相比，3号化合物比2号化合物体积大，而且氢键受体和供体的数量多，因此不同的极性修饰色谱柱的选择性有所不同。有互为先后甚至共流的现象。而整体的出峰顺序，则依然是疏水性低的保留弱，疏水性强的保留强。
以上四个物质的以文献上logP为基准来进行判断，显然不如用logD更能准确描述实际发生的情况。用logP判断保留会徒增不少不可解的烦恼。
氢键丰富的色谱柱，比如聚合物包被的硅胶材料，固定相为特殊空间结构的金刚烷类的Capcell Pak ADME-HR色谱柱能够对不带电的亲水性化合物有很好的保留。
例如亚硝胺类物质乙二醇亚硝胺的logD=-0.72,倒可以在此色谱柱上保留，主要倚赖较强的氢键。
氢键作用如图示。事实上硅醇基既能够由氢提供空轨道，也能够由氧提供孤对电子，因此本身即是氢键的供体也是受体。
苯基和五氟苯基色谱柱对苯环上的同分异构体的选择性通常会好于普通C18色谱柱。如果配合以甲醇作为流动相，选择性则更强。
融合了C18柱和PFP两种填料的色谱柱在保留和苯环异构体选择性上有独特之处，今年来获得很多认可。
对于这种羟苯磺酸这种看起来保留极为困难的物质，由于PFP有很特殊的保留能力，令其胜过了SB C18的保留。
以上的示意图为五氟苯基能够增大羟苯磺酸的基本原因。
再举一些碱基和核苷类物质为例，这些物质在C18色谱柱保留困难，然而在苯基柱上保留能力和选择性都很不错。
将这些化合物的疏水性进行分析，所有的物质的疏水性都在0以下。而且物质的保留时间与疏水性之间没有任何相关，此时试图用疏水性来解释保留的相关关系是没有任何意义的。
接下来，我们再来讨论一下混合模式色谱柱。
存在两种或者两种以上主要保留作用机制的色谱可称为混合模式色谱。在上一节讨论过的内容中，我们其实也是讨论了不少两种以上作用机制的色谱柱以及其案例了。
将多种不同的作用机制放入一种色谱柱内，通过排列组合，可以创造出很多有趣的色谱柱。通常的首要目的是将原来不保留的物质保留住，将原先要分开控制的物质放在一个方法内控制，将原先难以分离的物质通过另外的作用机理分开。
接下来，我们介绍三个广州菲罗门提供的案例。
第一个例子是疏水加阳离子交换的案例，将金属离子和疏水性的化合物在一个方法内进行分析，用不同的检测器可以分别进行检测。对阳离子有增大保留的效果，对含有羧酸的化合物则有排斥作用降低其保留，显然此时体系的pH就很关键，要调控布洛芬这样的物质的保留，实际上就要看pH调控布洛芬等电离的状态。
以布洛芬为例，如果pH从3向高去调，其负电状态比例增多，和色谱柱的斥力增加，布洛芬的保留会变差。当然布洛芬的保留还受有机相比例的调控，可以更改比例收放保留时间。有了两种或者两种以上的主作用，调控物质的保留的能力自然也有多种，一般是有机相比例，有机相种类，pH 和离子强度的诸多变化。而且以上都有可能是显著因素，这一点比反相方法要复杂多了。
这个案例给出的谱图量更多，因此可以进行横向或者纵向的比较来增进了解如何进行相关的研究。首先要清楚的是叠氮酸的pKa是在4.7左右，是一个和乙酸差不多强度的酸。
从1，3，5的比较图来看当pH=5.4时，当有机相的的比例从50%降到35%时，甲苯的保留变大。在pH5.4时叠氮酸带部分负电荷，通过离子交换作用在色谱柱上有较强的保留。此时叠氮酸的保留基本不受反相固定相的影响，它的保留减弱主要是因为洗脱它的离子浓度在升高。显然图5是比较有利的结果。
对于图形2，4，6来说是在较低的pH下完成的实验，千分之一的甲酸pH为2.8，千分之一的磷酸的pH是2.2, 千分之2.5的甲酸是在两者之间。此时叠氮酸是分子态为主，此时离子交换作用的依然也有作用，2.8的保留强于2.2下的保留，就是因为pH2.8时依然有带负电状态的叠氮酸存在。按照4.7的pKa估算pH2.8的叠氮酸带负电荷的比例可能只有1%。在2，4，6下，甲苯的保留是典型的疏水作用力，至于4，6图上甲苯的保留有变动，目前不能解释其保留时间偏移的原因，也许是实验的误差，也未可知。
接下来的案例是对氨基酸的直接分析。用反相色谱柱或者是亲水性的反相色谱柱，直接分析氨基酸在保留方面会有很大的困难。通常是用磺酸类离子对试剂在强酸性条件下进行尝试。本例是用了Hilic模式和阳离子交换模式来进行操作。
用hilic模式的时，疏水性大的分子会先出峰，疏水性小的分子后出峰。这里选取了三个代表性的氨基酸，可以发现其规律的确如此。pH2.7的时候，氨基酸的氨基肯定都带正电，与固定相有很强的离子交换作用保留强，用pH来调控目标分子的羧基离子化状态可以改变目标物的斥力的大小，可以推动目标物尽快出峰，避免保留过大。应当来说这种流动相的使用是超出了很多人的知识空间了，因此应用时要对离子化状态有很深刻的研究，就像在使用离子对试剂一样。
为什么要发明和使用混合模式色谱柱，实际上是希望能够将原来在流动相里用的离子对试剂做在固定相上，以减少离子对试剂的各种负面作用，比如色谱柱改性，鬼峰，峰漂移等等。如果势必要使用离子对试剂时，色谱柱上一定要做标记。不知情的人使用了被改性的色谱柱，会令其工作陷入很大的被动。这里就有一个例子。
使用了离子对试剂的色谱柱，保留时间可能会比新色谱柱更大一些，同时在旧色谱柱上能够分离良好的关键峰，在新色谱柱上发生分离困难。
在被改性的色谱柱上发现的分离度和耐用性良好的pH范围在新色谱柱上消失了。
借助梯度和pH的两因素响应面模型，重新寻找可用范围，最终重新找到了合适的方法。这是用建模的手段来解决了这样的问题，但这个问题实在不应该发生。在以上的图形中，横轴为梯度的结束比例视图（单阶梯度三要素：起始比例，结束比例，梯度时长，因此仅单阶梯度可以有和分离度相关的三种视图方式），纵轴为pH范围。图例里的白色区域为方法可用区域。可以见到新色谱柱上低pH区域内在梯度的帮助下可以找到橄榄形的两因素的耐用性范围，在较高的pH范围可以看到长条形的耐用性范围。关于数学模型的问题，留待第6节课讨论。
感谢大家的聆听，感谢安捷伦，星谱科技以及菲罗门的案例支持！今晚进行第五节课反相流动相的选择，欢迎大家继续支持我们的课程。
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