10-23 DNAzyme是最具催化活性的RNA剪切DNAzyme之一。它能够高选择性地切割多种RNA靶标，而保持其他有用的RNA链不受影响。这种高特异性的催化功能使其在疾病治疗和生物技术方面拥有巨大的应用潜力。然而迄今为止，在实际的医学应用中，DNA催化酶介导的治疗成功案例实属罕见，其重要原因在于科学家们对其催化过程中随时间变化的高分辨结构信息尚了解不足，因此很难开发出能在真实细胞中完成任务的改进型DNAzyme变体，而充分理解它的催化过程（包括实际的分子结构、动态过程和过渡状态）是促进DNAzyme技术突破性进展的首要基础。
德国杜塞尔多夫大学、波恩大学和于利希研究中心的Manuel Etzkorn研究团队对10-23 DNAzyme原型样本的所有表观状态进行高分辨率NMR表征，并对其动力学和催化功能的动力学进行了全面和深入的研究，从而揭示了DNAzyme-RNA底物的催化前配合物的独特分子结构、构象可塑性和金属离子动态调制之间错综复杂的相互作用，揭示了原子水平和时间分辨的催化机制。这些通过传统结构生物学技术无法识别的催化过程的关键特征，将推动未来以知识为基础的下一代DNAzyme的开发。
布鲁克应用团队将在本文中为您介绍这项研究所涉及到的重要的生物磁共振方法及实验设备的详细信息。
1. 2D 1H-1H TOCSY/2D 1H-1H NOESY/2D 1H-13C HSQC-TOCSY/3D 1H-13C HSQC-NOESY
这些实验用来对DNA和RNA进行序列归属。
通过脱氧核苷酸的碱基氢与自身或邻位脱氧核糖上的氢之间NOESY相关峰来进行DNA上的脱氧核苷酸的序列归属；通过脱氧核糖上的1H之间的TOCSY相关峰可以用来区分不同脱氧核糖的自旋体系；通过2D 1H-13C HSQC-TOCSY和3D 1H-13C HSQC-NOESY来对15N,13C-Dz5C–RNA2ʹF复合物C13信号进行归属。
图示：用于核苷酸序列归属的2D 1H-1H NOESY实验
2. 19F相关NMR实验-1D 19F/2D 19F-1H HOESY(19F检测)/2D 1H-19F HOESY(1H检测)/ 19F饱和的STD实验
这些实验用来对核苷酸进行序列归属，以及可作为长距离约束。
1H检测的HOESY可以对dG-6和dG-5进行直接的归属；19F饱和的STD实验中，19F取代的核苷酸可以通过来自偕位H2’和邻位H1’强烈的STD来进行归属，且谱峰显示出JFH的耦合裂分；异核HOESY和STD可以得到距离约束。
图示：用于核苷酸序列归属和长距离约束的2D 1H-19F HOESY/2D 19F-1H HOESY/19F饱和的STD实验
3. NOE buildup and eNOEs
NOE buildup数据是通过在一系列2D NOESY（混合时间分别为40, 80, 120, 180, 260, 400, 800ms）谱图中提取交叉峰面积，再通过eNORA软件拟合，在计算中考虑相对峰强度、各自自动弛豫速率以及对角峰上下交叉峰之间的转移机制，尤其是基于结构模型的氢氢自旋扩散效应，从而得出准确的交叉弛豫速率（eNOEs）。
图示：用于eNOE计算的NOE bulidup数据
4. 残余偶极耦合（RDC）
RDCs取决于两个原子核之间的距离，核间矢量相对于整体对齐张量的方向，以及对齐张量分量的大小。通常会测定有固定核间距离且化学键直接相连的两个原子核之间的RDCs（如该研究是 通过[1H,13C]-不去耦的HSQC谱提取RDC常数的），可以得到大量化学键直接相连原子核相对于彼此的方向信息。在该研究中，RDCs在确定DNA酶-RNA底物结构整体的最终折叠方式这一步起到关键作用。
图示：（左）用于提取RDC信息的1H-13C HSQC谱图；
（右）RDC实验观测值与结构簇III/I的RDC计算值之间的相关图
5. 顺磁弛豫增强（PRE）
PRE产生于顺磁中心中未配对电子和原子核之间的磁偶极相互作用，导致核弛豫速率的增加。顺磁中心既可以是大分子结构系统的内在组成部分，如金属蛋白，也可以是通过化学方法添加的外在组成部分，即顺磁标记。由于未配对电子的磁矩很大，PRE效应可以测量出顺磁中心与质子之间的较长距离。顺磁中心和感兴趣原子核之间的PRE与距离的6次方成反比，因此PRE可以提供动态过程中的结构相关信息，从而成为特别通用的工具。PRE是通过顺磁样品和抗磁性对照之间的核弛豫速率差来测定的。比如在该研究中，将顺磁性和抗磁性样品之间的二维相关谱（NOESY和TOCSY）中可分辨交叉峰信号峰值强度的比值用作PRE的度量，得出顺磁中心与质子之间的较长距离。
PRE不仅可以作为结构确定的辅助手段，更重要的是，它可以用于检测和表征大分子及其复合物动态过程中低含量的瞬态（sparsely populated states），这些低含量的瞬态通过传统结构和生物物理方法是无法观测到的（比如晶体学，常规核磁共振、低温电子显微镜、电子顺磁共振和单分子光谱 ），但在各种重要的生物过程中却发挥着关键作用，包括分子识别，变构，构象选择和诱导配合，以及各种组装过程。
6. NMR滴定实验
在该研究中，为了研究金属结合位点的作用机制，将催化前复合物Dz5C–RNA2ʹF进行Mg2+滴定，对于NOESY和TOCSY谱图中可分辨相关峰的化学位移和峰强度信息进行提取，通过化学位移扰动（CSP）数据拟合出Kd值。
图示：（左）Mg2+对催化前复合物结构整体的剪切活性（紫色）和在单个金属结合位点（I/II/III）诱导的结构修饰（CSPs，灰色）的依赖性比较；（右）Mg2+诱导的不同Dz变体中金属离子结合位点I和位点II核苷酸CSPs的比较。
以上的NMR实验分别在配备有H/N/C三共振超低温探头, H/N/C/P和H/N/C/F四共振超低温探头的布鲁克AVANCE III HD&NEO（600, 700, 750, 900, 1100和1200 MHz）核磁共振波谱仪上完成。
全新的布鲁克 1.2 GHz AVANCE NEO 超高场核磁共振谱仪具有无与伦比的稳定性和谱图分辨率，能够更好地加持NMR在结构生物学上的独特优势。目前在世界范围内已有多家科研机构安装了1.2 GHz AVANCE NEO超高场NMR谱仪，包括本研究团队所属的德国于利希研究中心。
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