Gut丨角鲨烯环氧酶通过促进细胞增殖和肠道菌群失调加速CRC进展

对三个独立的CRC队列（香港队列、TCGA 和 GDS4382）中SQLE的mRNA和蛋白表达进行分析，发现在原发性CRC组织中SQLE的 mRNA和蛋白的表达均高于对照癌旁组织。使用Kaplan-Meier曲线和多变量Cox比例风险回归分析评估SQLE对CRC患者预后的影响，结果显示SQLE mRNA的高表达与CRC患者差的预后相关，是CRC疾病特异性预后不良的独立因素。进一步借助免疫组化对207例CRC患者进行TMA分析也证实了SQLE能在蛋白水平上预测患者的预后（图1）。可见SQLE mRNA和蛋白表达是预测CRC患者生存不良的独立预后因素。

图1. SQLE在CRC中表达上调预示着较差的生存

在体外细胞水平上证实了SQLE通过抑制细胞凋亡和激活细胞周期进程来促进CRC细胞生长后，进一步在体内动物水平上以Rosa26-Sqle tg小鼠与Cdx2-Cre^ERT2小鼠杂交构建结肠特异性Sqle tg小鼠来探究SQLE在体内CRC发生中的相关性。与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠的肿瘤发生率、肿瘤数量和肿瘤负荷均显著增加，Sqle tg结肠内CRC形成，伴有结肠异型增生和高度异型增生的小鼠比例增加。同时Sqle tg小鼠在CRC中的致癌功能可以通过细胞增殖增加的Ki-67评分和细胞凋亡减少的TUNEL评分来证明。通过对小鼠的结肠组织进行癌症通路PCR分析，观察到细胞增殖标志物Mki67、Ccnd2和E2f4表达上调，而促凋亡基因Casp9和Casp2表达下调，从而证明Sqle在CRC肿瘤发生中促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。在CRISPR/Cas9的全身Sqle KO小鼠上构建AOM-DSS化学致癌模型，与野生型相比，Sqle KO小鼠结肠肿瘤数量减少，再次证明Sqle在体内结直肠肿瘤发生中的致癌功能（图2）。

图2. 结肠特异性Sqle tg小鼠促进结直肠肿瘤发生

SQLE是胆固醇生物合成的第二限速酶，在LOVO和SW1116细胞中，SQLE过表达增加了胆固醇生物合成基因（HMGCS1、HMGCR、MVK、PMVK、MVD、IDI1、FDPS和FDFT1）的mRNA表达，蛋白印迹分析发现过表达SQLE的细胞或Sqle tg小鼠的 HMGCR、FDFT1和FDPS 蛋白水平升高，而 SQLE敲低或Sqle^+/−小鼠相应基因的蛋白水平下调，提示SQLE能促进胆固醇从头生物合成，进而促进CRC细胞增殖（图3，图4）。

图3. SQLE过表达促进胆固醇生物合成基因表达

图4. SQLE敲低抑制胆固醇合成途径基因表达

肠道菌群失调是CRC发生的新致病因素，作者对Sqle tg和野生型小鼠粪便进行鸟枪宏基因组分析，Sqle tg小鼠的α多样性指数呈下降趋势，并测定Sqle tg和野生型小鼠的细菌组成变化，观察到Sqle tg小鼠中Desulfovibrio fairfieldensis, Rhodococcus erythropolis, Brucella abortus和Chlamydia muridarum等致病菌显著富集，而保护性细菌如Streptomyces violaceusniger和Pseudomonas sp Leaf58减少，经qPCR验证这些关键菌种类的变化，表明体内SQLE过表达促进肠道菌群失调。

已知富集的致病菌具有多种代谢活性，对小鼠粪便进行非靶向代谢组学分析，结果与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠粪便富含次级胆汁酸如石胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、去氧胆酸，并经靶向代谢组学证实Sqle tg小鼠次级胆汁酸如石胆酸、异石胆酸、异别石胆酸和去氧胆酸的升高。次级胆汁酸是在肠道菌群的作用下由初级胆汁酸转化生成的，对Sqle tg小鼠肠道菌群和代谢物进行相关性分析，发现次级胆汁酸和致病菌C. muridarum显著相关，提示C. muridarum可能参与促进次级胆汁酸的增加。此外，发现四种病原菌均与代谢物改变呈正相关，表明Sqle tg表达在小鼠CRC进展中调节肠道微生物组和代谢物（图5）。

图5. 结肠特异性Sqle tg小鼠肠道菌群和代谢物改变

次级胆汁酸作为一种内毒素，其水平升高是CRC的重要风险因素，它对结肠上皮细胞有毒性，破坏肠道屏障功能，而肠道菌群失调也与肠道屏障受损密切相关，因此，SQLE过表达诱导的肠道菌群失调可能会导致肠屏障功能障碍。通过对Sqle tg和野生型小鼠肠道屏障功能进行FITC-葡聚糖跨上皮通透性分析，发现Sqle tg小鼠血清FITC-葡聚糖水平更高，电子显微镜（EM）也观察到Sqle tg小鼠紧密连接的破坏。上皮紧密连接是由细胞连接蛋白维持的，蛋白质印迹分析发现Sqle tg小鼠结肠中的细胞连接蛋白Jam-c和occludin下调。此外，Sqle tg小鼠内粘液关键成分MUC2的mRNA水平也下调。肠漏诱导促炎反应，Sqle tg小鼠结肠组织炎症通路的PCR阵列分析显示CxCl3、CRP和CXCR2等促炎因子显著上调。综上，肠道菌群失调-代谢物轴可能导致 Sqle tg小鼠肠道屏障功能障碍。

进一步收集AOM模型的Sqle tg和野生型小鼠的粪便移植到无菌(GF)小鼠体内，以探究Sqle tg表达诱导的肠道菌群失调是否能影响结肠细胞增殖。在处死小鼠前进行FITC葡聚糖跨上皮通透性分析，发现Sqle tg小鼠粪便进行灌胃的GF小鼠血清中FITC-葡聚糖水平高于野生型小鼠粪便灌胃的GF小鼠，并经EM 证实肠道屏障破坏。同理与移植野生型粪便相比，移植Sqle tg小鼠粪便的GF小鼠细胞连接蛋白Jam-c和occludin表达下调，同时Ki-67染色表明其显著促进结肠上皮细胞增殖。总之，SQLE诱导的肠道菌群失调使肠道屏障功能受损进而促进结肠细胞生长（图6）。

图6. 肠道菌群-代谢物轴介导Sqle tg FMT小鼠肠屏障功能障碍

使用SQLE抑制剂特比奈芬处理HT29和DLD1细胞，发现特比奈芬在体外剂量依赖性抑制HT29和DLD1细胞生长。此外，特比奈芬也显著抑制原发性CRC类器官的生长。接着评估CRC常用化疗药特比奈芬与奥沙利铂或5-FU联合用药效果，发现特比奈芬使HT29和DLD1细胞对奥沙利铂和5-FU的生长抑制更敏感，联合指数(CI)定量评估表明特比奈芬与奥沙利铂或5-FU的联合用药具有协同作用，在体外协同诱导细胞凋亡。进一步建立裸鼠皮下移植瘤模型，将1106个HT29细胞植入裸鼠背侧，分为六组：（1）载体；(2)特比萘芬；(3) 5-FU；(4) 奥沙利铂；(5) 特比萘芬+5-FU 和(6) 特比萘芬+奥沙利铂。结果表明，单药治疗可抑制约50%的肿瘤生长，且与载体相比，特比奈芬+5-FU和特比奈芬+奥沙利铂用药均可使肿瘤完全停止生长，效果明显优于单药治疗。在CRC治疗中SQLE可作为治疗靶点，抑制SQLE可以提高CRC化疗效果。

图7. SQLE是CRC的治疗靶点

本研究通过细胞系、结肠特异性Sqle tg小鼠和Sqle KO小鼠模型建立了SQLE作为CRC的致瘤因子，明确了SQLE在CRC中的致癌作用，SQLE可以促进CRC细胞增殖和存活，并通过引起肠道菌群失调、代谢物改变、肠屏障功能障碍进而影响肠道肿瘤微环境。特比萘芬对SQLE的阻断作用对CRC细胞具有生长抑制作用，因此特比奈芬联合5-FU或奥沙利铂可以显著提高治疗效果，提示其在CRC治疗中的临床应用潜力。

Squalene epoxidase drives cancer cell proliferation and promotes gut dysbiosis to accelerate colorectal carcinogenesis. Gut. 2022. 

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