肿瘤微环境（TME）的各种免疫细胞类型会影响肿瘤细胞的进展和转移，但先前的研究尚不清楚肿瘤细胞和宿主器官是如何影响TME内免疫细胞的组成。近期，北京大学生命科学学院张泽民教授研究团队巧妙地通过单细胞转录组测序分析原发癌和转移癌的肿瘤微环境数据的表型关联，揭示了TME、肿瘤类型和宿主器官之间复杂的相互作用。该研究以“Immune phenotypic linkage between colorectal cancer and liver metastasis”为题，发表在Cancer Cell上。
研究材料
17名肝转移性结直肠癌（CRLM）患者的肝转移（Liv.Mets）、邻近肝脏（Adj.Liv）、原发性结直肠癌（Pri.CT）、邻近结肠（Adj.Col）、肠系膜淋巴结（MLN）和外周血；18名结直肠癌（CRC）患者的肿瘤、邻近结肠和血液；16名肝癌（HCC）患者的肿瘤、邻近肝脏、淋巴结、腹水和血液，共201例临床样本
技术路线
步骤1：利用单细胞转录组数据对CRLM、CRC、HCC样本进行免疫特征描绘；
步骤2：通过PhenoAligner方法识别多种与肿瘤进展或转移相关的关键性免疫细胞。
研究结果
1. CRLM、CRC、HCC免疫特征绘制
对51例未接受治疗的CRLM和原发性HCC/CRC患者的201例临床样本进行了scRNA-seq分析。CRLM样本，共鉴定出78个免疫细胞亚群。通过比较CRC和HCC样本的免疫细胞浸润情况，研究人员发现免疫细胞的浸润可能与病理状态相关（肿瘤/癌旁组织），也可能与其驻留的器官相关（肠/肝）：CD4_Treg-CTLA4，CD8_Tex-LAYN和Mph-C1QC富集在肿瘤组织中；CD8_Trm-KLRB1细胞和MAIT细胞倾向于在肝中富集，而IEL细胞和Mph-NLRP3细胞倾向于在肠中富集。
图1 CRLM、HCC和CRC不同的免疫特征
2. 通过表型对齐来解开癌细胞和宿主器官对TME的影响
为了去除跨癌种比较产生的潜在偏差，研究人员利用肿瘤转移患者自体对照的优势，设计了PhenoAligner算法，以CRLM为模型系统评估了宿主器官和恶性肿瘤对免疫细胞表型的影响。根据PhenoAligner的得分，开创性地把转移癌内部的免疫亚群分成三类：肿瘤型（Malignancy-type，M型）来自原发癌，组织型（Niche-type，N型）来自不同非癌组织，以及两种不同组织的混合型（Combo-associated-type，C型）。其中，NKT、DC以及T细胞属于N型，大部分的CD45-癌细胞和肥大细胞属于M型。
图2 使用表型比对分析癌细胞和宿主器官对TME的影响
3. CD8+ Texs 与恶性肿瘤相关且依赖于TCR
尽管Liv.Mets中的CD8+ T细胞被指定为N型，但根据PhenoAligner分析发现，它们的子集显示出不同的模式。基于PhenoAligner分析，CD8+ T细胞中耗竭T细胞（Tex）被鉴定为M型。进一步的TCR序列分析结果表明，在Pri.CT和Liv.Mets两个肿瘤位点间存在大量共享TCR克隆型数。据报道Texs的流动性非常低，作者认为产生这种TCR克隆型共享的可能的原因是，两个肿瘤部位的Texs源自相同的前体，并以TCR依赖性方式与相同的肿瘤相关抗原反应。TCR谱系追踪方法STARTRAC及RNA velocity分析证实了这一猜想，揭示了外周血中的Temra，Tem和Tex细胞之间存在紧密关系，可能由共同的前体细胞经相同的肿瘤相关的抗原刺激形成。
图3 CD8+ 耗竭型T细胞与恶性肿瘤相关且依赖于TCR
4. 原位癌和转移癌中相同的CD4+ T细胞，不同的发生机制
接下来，研究人员对CD4+ T细胞进行了类似的分析，Th17、Th1、Treg-IL10和Treg-CTLA4被表征为M型。结合TCR序列信息发现Treg-CTLA4和Th1-like细胞与Tex细胞一样呈现TCR依赖的模式，而Treg-IL10和Th17细胞则呈现TCR不依赖的模式，即在原发和转移肿瘤位之间没有共享TCR序列，该结果揭示CD4+ T细胞不同的发生机制，即不同肿瘤位点的Treg-CTLA4和Th1-like细胞来源于同样的前体细胞，而Treg-IL10和Th17细胞则是被肿瘤细胞从不同的起源招募而来。
图4 结直肠恶性肿瘤和宿主器官对CD4+ T细胞亚群的影响不同
5. SPP1+ TAM细胞与恶性肿瘤相关，并与肝转移有关
巨噬细胞的异质表型分析发现3个TAM簇被表征为M型。其中，TAM群体的表达模式显示，C1QC+ TAM高表达与免疫检查点治疗良好响应相关的基因（CXCL9和CXCL10），且主要发挥细胞吞噬和抗原呈递的功能，提示C1QC+ TAM可能在CRLM治疗中发挥有益作用。与之相反，SPP1+ TAM主要发挥促血管生成和促肿瘤转移的功能，且其表达的特征基因和更差的预后相关。值得注意的是，研究人员发现SPP1+ TAM不存在于原发肝癌中，却在结直肠癌的肝转移组织中显著富集。对淋巴结组织的分析也发现，SPP1+ TAM只在淋巴结转移的患者中被识别，提示SPP1+ TAM会促进CRC肿瘤细胞的转移，对其进行功能抑制可能会在CRLM治疗中发挥积极的作用。
图5 SPP1+ TAM细胞作为Liv.Mets的潜在罪魁祸首
6. 促炎型DC3细胞与恶性肿瘤相关
树突状细胞（DC）是抗原特异性免疫反应的关键细胞亚群之一，cDC2总体上表现出最高的异质性，其中cDC2 -C1QC细胞被定义为DC3，被表征为M型。DC3高表达C1QA，CD68，CD163和CD14，表现出更高的“促炎”特征，基于TCGA等队列的生存分析发现DC3的比例与预后不良相关，强调DC3作为进一步临床研究的DC亚群。
图6 促炎DC3在表型上与CRLM中的Pri.CT相关
小编小结
本文中作者通过多组织单细胞转录组数据分析阐明了转移癌免疫微环境的各种细胞亚群的可能来源。通过PhenoAligner方法识别到了多种与肿瘤进展或转移相关的关键性免疫细胞，比如属于M型的CD8+ T细胞，CD4+ T细胞，SPP1+ TAM，以及DC3亚群，有可能为寻找免疫疗法的靶点提供新思路。
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