分析方法在仪器间转移的案例

在研发分析实验室中，往往会遇到这种情况：在一台液相上开发的分析方法，转移到实验室其他仪器运行，尤其是仪器的品牌及型号有差异时，无法重现原有的实验结果。原因在于滞留体积、泵流速、比例阀性能等微小差异在叠加之后导致了色谱行为的显著差异。不同仪器之间出现这种差异的的原因，在于分析方法的耐用性差，需要进行进一步优化甚至二次开发。本文就是这样一个案例。

在某仿制药的原料药有关物质分析方法开发过程中，采用原料药粗品加若干种杂质对照品混合溶液；以色谱理论指导下的以单因素调整方式选择了高氯酸钠溶液体系、水相pH值和梯度，在Agilent1260（单泵四通道）确定了关键色谱条件如下，典型图谱见图1。

流动相A：50mmol/L高氯酸水溶液（以高氯酸调节pH1.5）

流动相B：乙腈

梯度表如下：

流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：20μl，检测波长：210nm。

图1：已开发方法的典型图谱

由于研发分析实验室和QC实验室中配置的仪器主要是岛津LC20AT，考虑到后续的方法验证和转移工作需要在岛津LC20AT液相上完成，因此在完成了此项有关物质分析方法开发的任务后，需要将此方法转移至岛津LC20AT液相上重现，确认已建立的分析方法能否在后续的工作中正常使用。

基于实验室液相品牌及型号的现状，将上述初步确立的有关物质分析方法色谱条件转移至两台岛津LC20AT（双泵）进行实验。分析研究员配制好流动相、混合对照品溶液、API供试品溶液后，分别置两台不同摆放位置的液相同时检测、结果见图2、图3。

图2：混合对照品溶液比较

图3：供试品溶液比较

结果表明：

基于上述情况，结合实验过程进行差异分析，结果详见表1。

表1：差异分析

图2、图3展示的色谱行为的差异，结合表1展示的色谱条件差异，表明当前的分析方法存在着极高的耐用性风险。此原料药及其一系列有关物质，均为碱性化合物，且伴随着离液剂高氯酸钠的应用，pH值、梯度、柱温必然会影响各组分的保留行为，进而影响分离度。但在方法开发阶段采用的单因素调整策略，无法关联与各组分保留行为相关的色谱条件。因此必须采用三因素正交实验设计建立响应曲面，建立不同组分保留行为对应的色谱条件，并寻找最佳色谱条件。

基于前述分析，分析研究员根据响应曲面实验设计的原理，进行了三因素、三水平的DOE试验（正交实验），实验设计方案见表2。

备注：

表2：DOE试验参数

试验结束后，分析研究员根据27针数据，利用AutoChrom软件嵌入的施耐德等专家总结的经验公式lnk=a+bx+cx²（pH值、B%模型）和lnk=a+b/T（柱温）构建各组分的保留与分离行为的模型，进而建立该有关物质分析方法的知识空间，以期找到耐用性合适的可操作空间。结果如下：

图4：梯度VS流动相pH值模型

图5：梯度VS柱温模型

根据建模结果，获取知识如下：

备注：此图谱为杂质加样供试品溶液运行所得。

图6：选定色谱条件运行所得典型图谱

根据DoE实验获取的知识空间，评估优化策略见表3.

表3：优化策略

按表3优化策略调整色谱条件进样，典型图谱见图7、图8.

流动相A：50mmol/L的高氯酸钠溶液（以高氯酸调pH值1.2）

流动相B：乙腈；按以下梯度洗脱

柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。

图7：混合对照品溶液

图8：供试品溶液

图7、图8的结果表明，利用降低柱温、流动相pH很好地改善了分离度，同时弥合了不同仪器差异导致的保留时间的差异，提高了有机相比例的耐用性，为后续的分析方法在不同品牌、型号的液相上重现降低了风险。

有关物质分析方法（HPLC）开发阶段，不仅需要关注方法参数，还应关注实现方法参数所涉及的仪器参数。不同仪器之间，每个单一组件微小的差异，在叠加后，可能会产生风险。部分方法参数与部分仪器参数及关联组件见表4。

表4：部分参数关联表

在方法开发阶段，分析方法性能的变化取决于分析方法参数的变化；而分析方法参数的变化需要由分析仪器实现。因此研发人员不仅需要针对“可见”的方法参数变化进行相应的研究（分析方法开发）；在分析方法验证前，还需要针对“看不见”的仪器参数变化（不同仪器间的差异）进行考察，即使型号完全“一样”的设备，也可能会引入某些未知的重现性风险，应在差异度足够的系统上测试已经开发完毕的方法，以确保耐用性。

通过开发阶段的DOE并构建数学模型，可以获取方法的知识空间，并充分理解各因素之间的交互作用。从一台仪器上构建的模型的知识空间的应用范围，可以延伸至其他的仪器上使用，降低分析方法在其生命周期内的重现性风险。