拿大Manitoba大学的生物化学与遗传医学部的McManus博士，同时也是Manitoba癌症中心的高级科学家，他的主要工作是致力于寻找癌症易感群体的异常基因，以及筛选针对这些变异基因的治疗药物。
McManus 博士的研究团队（本文封面图片）通过细胞学实验以及成像分析的方法研究及鉴定了多种导致基因组不稳定的遗传学高危因子，研究普遍结论认为此类基因突变会导致一些癌症的发病，包括结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌等。这些基因通常和DNA的损伤修复相关，其突变会引起染色体数量异常，肿瘤生长转移和患者预后较差。
关于DNA损伤
DNA损伤有许多不同的形式,如碱基修饰,DNA单链断裂(DNA single stranded breaks,SSBs),DNA链内和链间交联以及DNA双链断裂(DNA double stranded breaks,DSBs)等,其中DSBs被认为是DNA最严重的损伤，因此也成为诸多癌症易感基因的生物学评价标准及治疗靶点。
关于DSBs的检测方法，此前我们介绍过高通量彗星电泳，它是业内公认的反应DNA双链断裂的评价方法，除了彗星电泳之外，gammaH2AX的检测也是重要的DSBs早期标志物，有研究表明其时间效应甚至早于彗星实验的评价。所以γ-H2AX的检测体系也是McManus博士开展的重要的易感基因评估模型。
γ-H2AX的检测方法
细胞在DSBs发生后，产生一系列的应激反应，其中一个主要的反应就是毛细血管共济失调突变基因(ataxia telangiectasia mutated,ATM)起始的信号级联反应，它使细胞周期停顿直到损伤修复。H2AX是这一信号级联反应中的一个主要成员，它能被ATM磷酸化(称为γ-H2AX，或gammaH2AX)，并在随后的损伤修复过程中发挥着重要的作用。由于磷酸化的H2AX在DSBs位点形成焦点(focus)，且与DSBs的发生具有一一对应关系，因此可以作为标志物通过免疫荧光、流式细胞术或免疫印迹的方法检测。
免疫荧光成像法检测γ-H2AX的优缺点
免疫荧光成像检测γ-H2AX的方法相对流式细胞术及WB更加直观，并且可以评估单细胞水平γ-H2AX形成foci的数量，但是在不同的研究中,这种镜下观察得到的H2AX焦点的大小和荧光强度在不同的条件下可能发生变化，还可能受到非特异性染色的影响，因此,在分析免疫荧光结果时,不仅要分析焦点的多少,同时也要充分考虑到焦点的大小及强度所代表DNA损伤的程度。由于传统的荧光显微镜成像方法通量和图像分析功能的限制，往往认为免疫荧光成像检测的定量统计较差。
更好地解决方案——Cytation成像平台
γ-H2AX的foci检测中存在的定量统计问题，使用Cytation成像系统能够完美解决。Gen5成像分析软件的Dual Mask功能能够精细圈选每个细胞里的foci小点，并且对小点的数量及荧光强度积分进行统计，因此可以反馈每个细胞形成foci的情况。我们来看一下这个案例：
给予U251细胞系不同浓度的喜树碱，通过成像可观测到细胞内不同数量的foci形成。蓝色：DAPI标记细胞核 红色：CY5标记的γ-H2AX形成的foci。
Gen5软件可以对细胞总数进行圈选（图A），也可以通过second mask对细胞内的foci进行圈选（图B），进而Gen5软件可以统计出每个细胞内foci的总面积和总荧光强度。
通过Gen5软件的亚群筛选功能，采用统计学的方法设定阈值，可以挑选出DNA损伤应答的细胞群体（红色Mask圈选）。
软件可对每个化合物浓度的样品孔进行计算，从而分析不同γ-H2AX-foci评估标准下的化合物对DNA损伤的作用曲线。
基于3D细胞模型的易感基因筛选
除了DNA损伤修复评估模型之外，McManus 博士还开展了基于3D细胞模型的不稳定染色体的调节因子筛选。
他们使用Cytation3多功能细胞成像系统进行多重高内涵筛选实验，例如细胞核面积异常增大、微核形成等。而合成致死因子(Synthetic lethal interactors)能够针对这些遗传变异成为潜在的消灭癌细胞的治疗靶点，McManus 博士团队还在Cytation的平台上进行合成致死因子有效性筛选，成果已在多种知名期刊上发表。
BioTek提供的整体解决方案
BioTek为其团队提供了3D细胞筛选的整体解决方案，包括EL406高通量洗板分液仪，BioSpa8自动孵箱，以及Cytation3细胞成像系统。正是应用这套系统，McManus 博士团队能够对不同的调节因子影响肿瘤球形成过程进行实时监测，获得的数据相对此前的贴壁细胞培养系统更加贴近在体生理条件。
McManus 博士评价： “整合了BioSpa™ 8能够使我们开展更多的长时程、活细胞成像水平的工作…这相对传统的固定化终点法分析提供了更多的有效信息”
未来，McManus 博士还将对已鉴定的高位突变基因影响基因组稳定性的机制进行深入研究，并且在其一项临床合作项目中，将应用卵巢癌患者分离的原代肿瘤细胞构建3D培养模型开展药物评估，想了解更多的McManus 博士实验室的工作，请访问其实验室网站http://home.cc.umanitoba.ca/~mcmanusk/index.html。
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