寡核苷酸药物（Oligonucleotide）是一类由几十个核苷酸组成的，序列较短的核酸分子。其主要是通过基因沉默抑制靶蛋白的表达从而实现治疗疾病的目的。
与传统药物相比，寡核苷酸药物具有多重技术优势，包括：（1）特异性高；（2）高效性；（3）长效性，降低给药频率；（4）研发周期短，临床转化与研发成功率相对较高；（5）靶点丰富，适应症广等。目前人工合成的寡核苷酸药物分类如图1所示。其中反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰 RNA（siRNA）为临床中开发的寡核苷酸药物的主要形式。
图1
全球首款反义核酸药物于1998年获批上市，开启了寡核苷酸药物上市的征程；全球首款siRNA药物Patisiran于2018年获批上市，更具有里程碑意义，近两年来已有四款siRNA药物陆续获批上市。截止2021年，据统计全球已有16款寡核苷酸药物获批上市（如图2），有超过400个化合物处于研发阶段。除Spinraza作为孤儿药在中国获批上市外，暂时无其他产品在国内上市。
图2
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这里有一些修饰寡核苷酸的例子：
RNA是非常不稳定的，半衰期特别短。因此我们需要一些结构修饰，主要是为了抵消核酸酶的作用及更有利的药代动力学分析。譬如硫代磷酸化：用硫基团取代磷酸二酯骨架的非桥连氧，最大限度地减少了内切和外切核酸酶的水解，这样就使DNA或者RNA的寿命大大增长。但是从液相色谱的角度来讲，这些硫代磷酸化的DNA或者RNA会给我们分析带来一些挑战，因为在进行硫代以后，中间的磷原子变成了一个手性中心，这可以产生 2n 个异构体，其中 n 是硫代键的数量。现在关于引入手性对于这类分子的生物性能到底有没有影响还存在争议。但对于色谱分析来说，更多的手性异构体在反相色谱的分析中，会导致峰宽变宽。（图3）
其他值得注意的修饰是寡核苷酸的糖基团部分，通常是基于 RNA 的寡核苷酸 2 ’号位羟基的修饰。此处去除氢也使与磷酸二酯相关的水解最小化。
另外，对核糖本身的修饰如桥联核酸BNA（bridged）或锁核酸LNA（Locked）。这使得其具有更高的亲和力，更好的单碱基错配识别能力，并且对核酸酶的耐受性更高。
图3
关于寡核苷酸药物固相合成后的分析，目前我们重点来讲一下反相色谱分析：
除了离子交换填料，比如高效SAX填料，非多孔而是实心球加表面固定相的模式。纯化和分析中的一大类是反相色谱。这里主要使用的是混合硅胶C18固定相，因此其分离度和柱效都要高不少。飞诺美Clarity Oligo-RP固定相采用聚合物和硅胶键合填料颗粒，由于其在高pH下的稳定性表现，在寡核苷酸的纯化方面被广为使用。
针对医药工作者对寡核苷酸分析日益增长的需求，飞诺美推出全新bioZen® Oligo系列寡核苷酸分析产品。全新升级的BioTi生物兼容性硬件，提高色谱柱的分析灵敏度和稳定性。与传统不锈钢硬件相比，BioTi在低进样量的分析条件下能有效改善回收率，尤其对生物样品中的寡核苷酸表征和定量分析中有着优异的效用。
此外，bioZen® Oligo系列的核-壳颗粒，具有高度均一的颗粒形态，从而保证了高柱效并缩小峰宽。尤其在寡核苷酸反相分析所需的高pH和高温条件下，仍有稳定优异的分离表现。
通过bioZen® Oligo系列产品与Clarity™ Oligo™系列的配合，飞诺美为寡核苷酸的前处理和分析提供了全套的解决方案。
寡核苷酸属于酸性强极性化合物，在一般色谱柱上很难保留。所以我们需要加入离子对试剂来进行其中离子对反相色谱分析，如图4所示离子对试剂增强寡核苷酸在反相色谱上的保留原理主要基于两点：首先，带正电的离子对试剂会与带负电的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中构成离子对，减少了寡核苷酸的净电荷并增加了其疏水性，此时疏水相互作用促成了寡核苷酸在离子对反相色谱中的保留；再者，离子对试剂依靠其疏水性烷基链可以吸附于反相色谱的固定相上以形成离子交换剂（Ion exchanger），此时静电相互作用将帮助寡核苷酸在反相色谱中的保留。
图4
离子对试剂的种类繁多，最常用离子对主要为基于乙酸胺试剂和基于六氟异丙醇（HFIP）的胺类离子对试剂。但基于 HFIP的离子对试剂较基于乙酸的离子更为常用，因为与乙酸相比，HFIP的沸点和酸性更弱，这意味着 HFIP 在电喷雾离子化的气相状态下更容易挥发，对寡核苷酸的离子化干扰更小，与电喷雾质谱更兼容。常见的离子对试剂主要有三乙胺（TEA）、醋酸三乙胺（TEAA）、碳酸三乙胺（TEAB）、六氟异丙醇（HFIP）。图5整理一些关于用于反义寡核苷酸的色谱方法参数。
图5 通过TEA和HFIP平衡离子对和离子抑制
（建议优化的浓度配比）
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典型图谱示例如下：
第二部分：寡核苷酸的生物分析样品处理解决方案：
为了解决寡聚核苷酸样品制备所面临的挑战，飞诺美先后推出了Clarity OTX 96孔板和寡聚核苷酸样品前处理裂解液，使得整个SPE前处理时间最优可降低至15分钟，大大缩短实验室花费在样品前处理上的时间成本。
高灵敏度寡核苷酸样品的净化和萃取/
☞ 典型萃取回收率 > 80％（有些Oligo药物优化后可达90%以上）
☞ 无需液液萃取（LLE）
☞ 适用于大多数治疗性寡核苷酸、组织和体液样品
☞ 针对 LC-MS 生物分析进行了优化
☞ 可以实现自动化以提高通量
Clarity OTX -SPE操作概述
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请注意：裂解液的使用体积，平衡时的pH值，洗脱时调整到pH为9.5等这几个参数非常重要。
Q & A
常见的OTX-SPE操作问答
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1.使用Clarity OTX产品可以从生物液体中提取什么类型的药用寡核苷酸？
DNA、RNA、miRNA、siRNA、硫代磷酸、LNA、单链、双链和寡核苷酸药制剂。只要存在磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架，提取方法都具有良好的纯化效果和回收率。要注意当遇到硫代磷酸酯骨架的siRNA，在最后一步洗脱液中可以加入少量的TCEP，提高提取回收率。
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2.一般可以检测到的浓度范围是多少？
对于某些寡核苷酸来说，可以实现到 1-2000 ng/mL 的线性校准曲线。由于每种寡核苷酸各不相同，并且每种液体/组织的基质都很独特，因此会有不同的定量曲线范围。
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3. 所含缓冲液是否具有核酸酶抑制作用？
是的，具有核酸酶抑制作用。目前配制的裂解上样缓冲液可进行细胞裂解并去除生物液体中的所有蛋白酶活性。
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4. SPE板的填料mg规格如何选择，核酸药是否在组织中分布的更多？
一般血浆样品处理可以选择25mg规格（8E-S103-CGA）；组织样品可以选择100mg（8E-S103-EGA），因为核酸药在组织中分布量更大，肝/血浓度能高达几百倍以上差距。
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5. 是否需要正压或真空负压？
在大多数情况下是需要正压或负压装置。Clarity OTX填料的粒度不适用于重力萃取。需要负压装置能够达到至少10英寸汞柱的压力, 在生物分析行业一般选择正压SPE装置比较多，推荐艾杰尔正压萃取装置(P/N: SPE-M96) 。
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6. Clarity OTX提取柱管和96孔板能否重复使用？
不能重复使用。与目前的提取程序不同，Clarity OTX产品需要使用裂解液buffer才能从生物液体中分离和提取寡核苷酸。提取目标低聚序列时，基质污染物保留在介质上。因此，即使经过反复严格地清洗，也无法有效去除这些污染物。所以重复使用会污染后续样品。
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7. 在核酸药的提取过程中有哪些注意事项，需要低吸附板，枪头吗？如何提高提取回收率？
是的，请全程带手套操作，尽量配置低吸附孔板，枪头等；提取回收率的提高请注意三点：一定要保证裂解液在有效期内，第一步将核酸药与血浆或组织样中的蛋白解离，然后将SPE板活化好之后，在酸性条件下将样品load到SPE板上，pH值为5~7之间（依据核酸样品种类不同可以微调）；在wash的步骤上可以优化，最后一步Elute的步骤要调节pH为9.5左右非常重要；然后将样品进行氮气保护下的吹干，一般设置温度为45摄氏度左右。
常见订购信息如下：
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