高质量LNP综述！程强/魏妥发文详述mRNA-LNP技术在癌症治疗中的应用

随着COVID-19 mRNA疫苗（如Comirnaty、Spikevax和石药集团SYS6006）的成功上市，脂质纳米颗粒（LNP）已被证明是最安全、最有效的载体，能够帮助mRNA进入人体靶细胞。这种先进的技术不仅有助于实现快速研发和生产疫苗，而且在其他领域，如基因治疗和癌症治疗中也有广泛的应用。对于有志于了解最新医学技术的读者来说，了解LNP是如何改变我们对疾病治疗的认识，无疑是一件非常有趣的事情。

mRNA用于癌症治疗，也随着Moderna在研的新抗原疫苗mRNA-4157与默沙东Pembrolizumab的联合疗法获得美国FDA“突破性疗法”认定，而成为了新冠疫苗后mRNA疗法的下一个重要战场。

近日，来自北京大学的程强（星锐医药科学创始人）课题组与中科院动物所魏妥（星锐医药科学顾问）在期刊Advanced Materials上发表了题为“Lipid Nanoparticle (LNP) Enables mRNA Delivery for Cancer Therapy（LNP递送mRNA 用于癌症治疗）”的长篇综述文章。该综述总结了LNP-mRNA配方的主要发展策略，讨论了目前具有代表性的mRNA癌症治疗方法，并指出了该研究领域当前面临的挑战和可能的未来方向。

通常来说，LNP由4种组分构成，包含1)可电离阳离子脂质、2)磷脂、3)胆固醇和4)聚乙二醇(PEG)脂质。每种成分均在决定LNP的稳定性、转染效率和安全性方面起着至关重要的作用。

图1. LNP组分代表性结构

LNP-mRNA的包封制备：需要将乙醇-脂质混合物与含有mRNA分子的酸性水缓冲液（pH 4~5）按1:3的比例，通过微流控装置进行混合，实现自组装。组装过程中，可电离阳离子脂质首先被质子化并带正电荷，通过静电吸附作用与带负电荷的mRNA结合。同时，其它辅助脂质包括磷脂、胆固醇、PEG脂质在这之上进一步组装，形成稳定的LNP-mRNA。随后，通过缓冲液交换将mRNA-LNP溶液透析到PBS缓冲液(pH 7.4)中，去除未包封的mRNA、多余的脂质和乙醇，并调整到中性pH，使可电离脂质不带电，在生理pH下更加稳定且毒性更小。

LNP的主要开发策略，包括1)新型脂质分子的设计和筛选；2)LNP组分配方优化；3)LNP表面修饰；4)给药途径的选择。

可电离阳离子脂质是LNP配方中的关键成分，其酸解离常数（pKa）决定了LNP的电离行为和表面电荷，并进一步影响LNP的稳定性和毒性。

传统的永久电荷阳离子脂质如DOTAP（溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵）在早前用于核酸递送的研究中，被发现极易与体内带负电荷的血清蛋白发生凝聚，将导致LNP被单核吞噬细胞系统快速清除，严重缩短了LNP的体内半衰期。且该凝聚作用增加了毒副作用的风险，导致红细胞膜破损和溶血。

由此，pKa值为6.0~7.0的可电离阳离子脂质应运而生。可电离脂质LNP（iLNP）确保了核酸在酸性条件下包封(pH 4.0，脂质被质子化)，并降低了体内循环过程中的毒性(pH 7.4，脂质变为中性)。LNP进入内涵体/溶酶体(pH低于表观pKa)后，LNP可以再次带正电荷，促进内涵体逃逸，将搭载药物释放到细胞质中。研究发现，LNP的pKa值在6.2-6.5和6.6-6.9时分别利于体内肝递送siRNA和肌肉注射mRNA疫苗。

可电离阳离子脂质结构可分为三部分：胺基头部基团（Headgroups）、疏水性尾部基团（Tails）和内部连接片段（Linkers）。

图2.可电离阳离子脂质结构

根据头部基团的胺基数量，阳离子脂质又可以分为单胺基或多胺基脂质。最著名的DLin-MC3-DMA(MC3)、SM-102和ALC-0315均是单胺基脂质，也是FDA批准的唯三可用于RNA递送的可电离阳离子脂质。然而这三种可电离阳离子脂质都不可经生物降解，在体内蓄积将产生潜在的细胞毒性。

研究人员通常专注于脂质尾部结构的调整，通过改变尾巴数量、设计线性或分支结构以及引入不饱和或可生物降解键来增强效力或赋予特定功能。例如，MC3的不饱和尾部促进了siRNA的内涵体逃逸，L319的酯键可加速细胞内脂质的降解。

在体或体外的高通量筛选(HTS)是获得优质候选脂质的常用手段，大多数文中提及的优质脂质都源于HTS。其中肝脏靶向LNPs的筛选是目前最易实现的。有研究表明，血液中大量的载脂蛋白E(ApoE)可以被吸附到常规LNPs的表面，从而通过ApoE-LDLR(低密度脂蛋白受体)的相互作用促进其肝细胞进入。

5A2-SC8就是基于HTS获得的一例具有代表性的肝靶向脂质，该脂质是由器官选择性靶向(SORT)技术奠基人Daniel Siegwart团队发现的。他们的早期研究表明，5A2-SC8 LNP可以在体内高效递送let-7g肿瘤抑制性miRNA，显著抑制原位肝癌的生长，延长小鼠生存期(图3A)[2]。

HTS也同样为肝外靶向递送脂质筛选提供了可能。Robert Langer与Daniel Anderson等人就以此设计了一种脂质聚合物7C1，有效将RNA递送到包括肺和骨髓等多个器官在内的内皮细胞（图3B）。该团队还设计了一类OF-Deg-Lin LNP，可在脾脏中有效产生蛋白(>85%)，并在体内实现B淋巴细胞的有效靶向(~7%)，显示了该配方载体具有调节B细胞功能的潜力(图3C)。

近期还有多种新型可电离脂质被高频使用于mRNA疫苗开发，如4N4T(MIC1和MIC2，威斯津生物)、IC8(威斯津生物)、不饱和三烷基化脂质10(Genevant)和YK009(悦康药业)。

图3. 基于HTS筛选的代表性新型可电离脂质

除了高通量筛选HTS之外，探索可电离阳离子脂质和/或偶联靶向部分的构效关系(structure-activity relationships, SAR)，可以为指导LNPs的设计提供一条合理的途径。例如含咪唑(imidazole groups)的类脂质体经体内体外实验验证，可将mRNA递送至T淋巴细胞；杂环胺头基类脂质通过干扰素基因刺激物(STING)途径激活免疫细胞，显著提高了mRNA-LNP癌症疫苗的抗肿瘤疗效(图4E)。

来自塔夫茨大学的许巧兵教授团队通过在丙烯酰胺尾部基团中引入酰胺键，开发了名为“N-Series”的一系列LNPs，实现肺部选择性靶向(图4A)。该团队还受到神经递质(如色胺衍生物tryptamine derivatives)的血脑屏障(BBB)渗透机制启发，开发了由神经递质衍生的NT-类脂质LNPs，成功地将小分子药物、核酸和蛋白质通过血脑屏障传递到神经元细胞中，实现了有效的脑部递送(图4C)；

Drew Weissman和Michael Mitchell等人设计了由茴香酰胺(anisamide)获得的类脂质AA-lipidoids，可以有效结合活化肝星状细胞(HSCs)上过表达的sigma受体，用于治疗肝纤维化(图4B)。该团队还设计了一类双膦酸盐(bisphosphonate, BP)功能化的可电离脂质并成功制备BP-LNPs，小鼠实验显示可增强mRNA-LNP的骨微环境递送(图4D)。

图4. 通过SAR设计的可电离脂质，可用于特定组织/细胞靶向

磷脂是帮助脂质纳米颗粒自组装和内涵体逃逸的辅助脂质。在临床前研究和临床应用中，常用的磷脂是DSPC和DOPE。

程强与魏妥研究员早前与Daniel Siegwart等人开发了一类可电离辅助脂质iPhos，其含有两性离子头部和三个烷基尾部的独特结构更容易引起内体膜融合并促进载物释放，性能显著优于DSPC与DOPE。

另有研究表明，磷酸乙醇胺(PE)头基对增强LNPs的膜融合和内体逃逸具有重要意义，且带有极性的磷脂可以改变载体器官靶向性。

胆固醇有助于增加LNPs的稳定性，并帮助细胞膜融合，优化胆固醇的结构也可以提高LNPs的递送效率并赋予LNPs特定的功能。

有研究在天然胆固醇类似物中筛选了显著提高转染效率的β-谷甾醇LNP(eLNP)，他们通过分析该胆固醇类似物的SAR，发现eLNP具有多面体结构形态并由不同的表面脂质组成，这可能有助于内涵体逃逸和mRNA释放。

聚乙二醇(PEG)脂质主要作用于减少纳米颗粒聚集，减少单核吞噬细胞吞噬，延长系统循环时间。然而PEG脂质也会阻碍于靶细胞的相互作用和内涵体逃逸，降低转染效率。

研究数据表明，碳链越短，解吸速度就越快，二烷基链的长度和聚乙二醇化脂质浓度/分子量显著影响LNPs在体内的药代动力学、药效学和生物分布。

PEG脂质也不可避免地带来了例如超敏反应、血液清除加速，以及重复给药引起的PEG抗体相关全身免疫原性。目前已开发了多种PEG替代脂质以提高LNP安全性有效性，包括聚甘油/poly(glycerol), 聚恶唑啉/poly(oxazolines), 和聚氨基酸/poly(amino acid)s。

2020年4月，Daniel Siegwart教授、程强研究员、魏妥研究员等在Nature Nanobitechnology期刊发表论文，开发了一种新型器官选择性靶向纳米颗粒平台——SORT。SORT递送系统通过在广泛使用的四组分LNP系统添加阳离子脂质(例如DOTAP)、阴离子脂质(例如18PA)或可电离脂质(例如DODAP)作为第五组分，可使mRNA选择性递送到小鼠的肺、脾或肝脏。2021年12月，他们在《美国国家科学院院刊》(PNAS)发表论文，解析了SORT系统能够实现器官特异性靶向递送的潜在机制，还利用iPhos脂质开发了新一代的SORT LNPs(iPLNPs)。

图5. SORT递送系统及其潜在机制

除LNP的脂质组成外，N/P（N为可电离阳离子脂质的胺基，P为mRNA的磷酸基）的摩尔比对LNP的性质也有很大的影响。在新冠mRNA疫苗中，N/P比值通常为3:1至6:1。随着N/P比值的降低，每LNP中mRNA的有效载荷会得到升高，但相应的mRNA包封率可能会降低，因此简单地增加N/P比率并不总是可取的，仍需要针对实际应用场景进行微调。

表面修饰是赋予LNP功能的有效途径。特别是将抗体、多肽或其他分子（透明质酸、适配体、DNA、甘露糖等）偶联到LNP上可以提高其靶向能力。

Robert Langer团队优化靶向内皮细胞的LNP配方过程中，引入了内皮细胞特异性表达的甘露糖和GALA肽分子等靶向配体修饰LNP，有效实现了肝内皮细胞的精准靶向。

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图6. 具有代表性的LNP表面修饰策略

根据组织解剖学结构，组织功能，和适应症对策，选择最佳的给药途径是非常必要的。

静脉注射是肝脏靶向治疗的最佳选择，因为mRNA-LNP在血液循环时很容易到达肝细胞。而疫苗通常使用肌内注射，注射后mRNA-LNP主要分布于注射部位的结缔组织和引流淋巴结，由mRNA编码的抗原被抗原呈递细胞(APC)处理，并呈递至T淋巴细胞激活免疫反应。一些新型给药装置也有助于优化mRNA-LNP疗法，例如微针贴片，吸入制剂等，可以减少注射疼痛感甚至提高免疫原性。

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李博文等开发新型LNP载体，吸入后可实现对肺部的高效mRNA递送及基因编辑

图7. 给药方式及其应用

mRNA作用迅速，成本低，可以被灵活设计成表达任何蛋白质来诱导所需的免疫反应，如递送编码肿瘤抗原的mRNA激活免疫，或编码关键细胞因子、免疫检查点抑制剂或其他功能蛋白，以重塑肿瘤微环境(TME)并恢复免疫适应性。此外，与常规疗法结合也是一个有吸引力的癌症治疗策略，在癌症治疗领域具有巨大潜力。

图8. mRNA用于肿瘤免疫疗法的主要路径

mRNA被递送到抗原呈递细胞(APC)中，表达肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤新抗原，通过主要组织相容性复合体(MHC)呈递至T淋巴细胞，激活CD4+和CD8+T淋巴细胞，最终杀死肿瘤细胞。

图9. mRNA-LNP肿瘤疫苗的作用机制

根据这些肿瘤疫苗的靶向性，可以通过静脉注射、肿瘤内注射、皮内注射或肌肉注射来施用。目前已有多款mRNA-LNP癌症疫苗进入临床试验阶段，其中有少数已进入2期临床阶段。

图10. 临床试验中具有代表性的mRNA癌症疫苗

通过序列设计，mRNA也可以编码治疗性抗体。目前普遍认为。由mRNA产生的抗体比直接基于蛋白质的抗体具有更长的半衰期和更低的成本。截至目前，mRNA已被设计用于表达多种抗体，包括单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）及其衍生物。

利妥昔单抗是一种针对CD20的单克隆抗体，用于治疗非霍奇金淋巴瘤。CureVac的研发团队就成功使用mRNA-LNPs在体原位生产利妥昔单抗并在体内外验证了其抗肿瘤疗效。在Raji模型中，即使是低剂量的mRNA-LNPs就可以比重组利妥昔单抗显示出更好的肿瘤抑制效果[2]。

细胞因子是一类分泌蛋白，在免疫系统中调节多种细胞类型和细胞活动。一些细胞因子已经通过抑制肿瘤的发展和进展而被广泛测试用于癌症治疗，如IL-12、TNFα和IFN-γ。

Moderna与阿斯利康共同研发的MEDI1191（mRNA-6231）就是一类编码含有IL-12α和IL-12β亚基单链融合蛋白的mRNA肿瘤疫苗，目前已完成临床I期实验，在晚期/转移性实体瘤患者中显示出初步的抗肿瘤活性。

截至目前，FDA已经批准了6种CAR-T细胞疗法，还有成百上千款CAR-T、CAR-NK疗法临床试验正在世界范围内进行，展示了过继细胞疗法的美好未来。与通常使用的将CAR以DNA形式插入到宿主细胞基因组的方法相比，mRNA形式的CAR具有瞬时表达和无基因组突变风险等多种优势，正在变得越来越有吸引力。

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体外生产：

体外生产CAR-T或CAR-NK细胞通常使用电穿孔技术，但电穿孔可能引起严重的细胞毒性，难以转化到人体内使用。目前已有多项研究利用mRNA-LNP平台成功在体外生成CAR-M及CAR-T细胞，并展现了良好的临床前抗肿瘤效果，为基于mRNA的CAR细胞生产提供了一种更简便的方法。

体内生产：

与传统的体外CAR细胞工程相比，利用mRNA技术直接在体内原位生产CAR-T细胞更具吸引力，有望解决当前CAR-T细胞疗法生产工艺复杂、周期长、价格高昂的难题。目前已有多项体内原位生产CAR细胞的概念验证性研究，相信在不久地将来会有更多有前景的研究陆续出现。

图11. 基于mRNA-LNP的体内CAR-T策略

溶瘤病毒（OV）能够选择性杀死肿瘤细胞并调节肿瘤微环境以治疗癌症。然而，其重复给药可能会引发抗病毒免疫反应，从而导致治疗效果降低。

RNA癌症疗法研发公司Oncorus就成功将病毒基因组RNA（vRNA）封装到LNP中，开发出一种合成RNA溶瘤病毒平台[3]。利用这一策略构建的合成溶瘤病毒能够在肿瘤细胞中选择性复制，并介导有效的免疫激活。值得注意的是，这种合成溶瘤病毒在体内已有中和抗体存在的情况下仍然有效，这表明RNA-LNP平台在克服重复给药挑战方面具有巨大潜力。

肿瘤抑制因子是指由肿瘤抑制基因表达的蛋白质，具有调节多种与肿瘤发生和抑制相关信号通路的能力。在许多类型的肿瘤细胞中，肿瘤抑制蛋白如PTEN和p53经常发生功能失调。通过mRNA恢复这些基因及其表达的蛋白的功能，可以调节细胞的抗肿瘤过程并诱导细胞凋亡，这为癌症治疗提供了一种有希望的策略。

哈佛医学院施进军教授团队将G0-C14、PDSA、DMPE-PEG和DSPE-PEG组成的脂质纳米颗粒聚合物混合编码p53的mRNA用于癌症治疗。他们发现p53抑制因子不仅可以通过诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞抑制肿瘤细胞生长，还可以使肿瘤细胞对依维莫司（mTOR抑制剂）敏感（图12C）[4]。

图12.基于mRNA-LNP的恢复肿瘤抑制因子策略

基因编辑技术可以通过删除、插入或改变宿主基因组中的特定DNA序列。以CRISPR为代表的基因组编辑技术的出现，彻底改变了当前的生物医学研究，并推动了该领域许多令人兴奋的进展。

CRISPR-Cas9系统已被广泛用于治疗罕见遗传性疾病，例如β-地中海贫血、镰状细胞病、转甲状腺素淀粉样变性、遗传性血管性水肿和血友病等。而且，它也是治疗癌症的有力工具。随着递送系统的快速和显著发展，CRISPR-Cas9系统可以以RNA、DNA或RNP的形式被递送到细胞中。与DNA和RNP形式相比，Cas9 mRNA和sgRNA的共递送方式具有更高的有效性和安全性，被认为是更有吸引力的方式。

Cas9 mRNA一旦进入靶细胞中，就能在细胞质中产生Cas9核酸酶，然后与特定的sgRNA形成Cas9-sgRNA复合物，从而实现高效的基因编辑。除了CRISPR-Cas9系统外，其他有前景的基因编辑工具，例如碱基编辑（Base Edting）和先导编辑（Prime Editing）也可以通过RNA-LNP的形式递送，同样具有巨大的癌症治疗潜力。

图13. 基于mRNA LNP的基因组编辑用于癌症治疗

在2019年之前，人们普遍认为至少需要五年的时间才能看到mRNA疗法应用于人类。而新冠大流行加速了mRNA技术的发展，将这项了不起的技术提前带给了人类。

2020年底，BNT162b2（BioNTech/辉瑞）和mRNA-1273（Moderna）获得紧急使用授权用于抗击COVID-19，标志着2020年成为mRNA技术发展史上具有里程碑意义的一年。从那时起，基于mRNA的疗法成为临床转化的超级热点。仅在2021这一年，就有超过20亿美元的资金投入了mRNA技术转化。在这一年，来自中国的艾博生物（Abogen）完成了7亿美元的C轮融资，这也是有史以来最大规模的IPO前单笔融资之一。

mRNA疫苗已经在抗击COVID-19方面取得了成功，但该平台在开发预防性和治疗性疫苗方面同样具有巨大潜力。最近，Nature 杂志将mRNA疫苗列为2023年值得关注的科学事件之一，这表明该平台得到了高度和持续认可。从长期来看，这一领域也是乐观的，预计由于对新冠mRNA疫苗的需求减少，mRNA疫苗市场可能会在短期内下降，但将从2028年开始增长，到2035年达到230亿美元规模。

就技术本身而言，mRNA疗法的成功高度依赖于其递送载体，而LNP是最好的递送载体选择之一。在这篇综述中，程强、魏妥等总结了LNP的开发策略，包括设计每个脂质成分，平衡内部脂质比例，修饰LNP表面，以及优化给药途径。如上所述，大量研究表明mRNA可以有效地递送到肝脏、肺、脾和大脑。随着进一步发展，还将有更多的器官和组织能够被靶向递送。更进一步，未来应该更多关注于靶向递送到特定组织中的某些细胞类型。在靶向给药的同时，消除LNP的免疫原性和毒性也不容忽视。结合可生物降解材料，优化剂量，并开发新的脂质替代品有望解决这些问题。

该综述还重点回顾基于mRNA-LNP的疗法在癌症治疗中的进展，系统回顾和讨论了癌症免疫治疗、恢复肿瘤抑制基因、基因组编辑疗法等具有代表性的癌症治疗方法，并总结了它们的最新临床状态。

值得注意的是，最近开发的在体CAR-T细胞疗法为癌症治疗开辟了新途径。传统的CAR-T生产是一个相当复杂且耗时的过程，包括自体T细胞的提取、CAR基因的转染、扩增和激活、回输到患者体内。而直接在体内生产CAR-T细胞可以解决上述问题，为晚期癌症治疗提供了一条有希望的新途径。当然，这一方法仍有许多问题或限制需要解决：瞬时mRNA生成的CAR-T细胞是否能够支持长期抗肿瘤作用？是否能够精确地将CAR mRNA递送到T细胞而不是其他细胞以避免脱靶效应？

随着细胞类型靶向LNP和mRNA长效表达技术（例如环状RNA、自复制RNA）的发展，这些问题可能得到部分回答。论文作者对这一方向持乐观态度，并期待很快看到更多进展，论文作者还表示，希望这篇综述提供的信息可以帮助设计更好的LNP载体，并制定适当的策略来改进基于mRNA的癌症治疗。