问：请问小分子和大分子的界限在哪里？色谱分离时分离大分子和小分子有什么差异？
答：小分子和大分子很难、也不应该有太严格的界限，甚至在不同的领域，可以有不同的界定。在色谱分析的角度，如果以原子数为标准，通常定义至少1000个原子通过共价键连接而成的化合物；更常用的是以分子量M为标准，M小于约2000的为小分子，M大于5000的为大分子，2000~5000之间灰色地带，包括寡聚体分子。如图1分别是赖氨酸这种小分子和Apaf1这种著名的大分子蛋白。
图1 赖氨酸结构式和Apaf1
由于绝大部分的色谱填料都是多孔材料（也有少量专门为大分子而设计的无孔材料），而孔径是其重要的参数。当分析物分子能够自由进入空隙体系并能在孔内自由扩散时，从能与固定相进行充分的作用，从而获得好的保留和分离效果。为了实现这个目的，一般要求孔径的大小应大于溶质的流体动力学的直径的3倍。表1为蛋白质在无规卷曲和球形状态下的直径和分子量对照。
表1 蛋白质的直径和分子量对照
但是当孔径增加时比表面积也会随着下降，如表2数据所示：
表2 孔径对比表面积的影响
如图3，对于小分子肽类血管紧张素I和II（每个分子量约为1000 Da）,它们达到最大保留值时，孔径为10 nm，当孔径小于10 nm时，两种肽类均被排阻而保留值降低；当孔径大于10 nm时，色谱柱的比表面积下降，因此其柱容量和保留值也会随之降低。
图2 孔径对血管紧张素I和II的RPC保留值的影响（C18，35% ACN, pH 3.2的磷酸盐缓冲液）
从上面的讨论和数据中可以看到，从色谱分析的角度上来看，大分子和小分子的概念可以指导我们选择合适孔径的填料来获得最佳的分析效果。这在反相模式里很重要，在体积排阻里更加重要。
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参考资料
1. S.C. Moldoveanu, V. David, Selection of the HPLC Method in Chemical Analysis, 1st. 2017, Elsevier Inc.
2. L.R. Snyder, J.J. Kirland, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd. 2010, John Wiley & Sons, Inc.
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