AQbD系列课程节选：分子理化属性的计算和应用

ACDLabs CN

2022.5.23

作者 ACD

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精彩回顾

以下是液相色谱知识空间培训系列课程，第二讲内容

ACD/Labs将节选小部分课程，

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今晚 19时，第三讲开启，

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大家晚上好，很高兴和大家在网上相聚。我是ACD/Labs中国区的经理阎作伟。今天是ACD/Labs团队和识林团队一起打造的AQbD系列课程的第二讲，授课的内容是分子理化属性的计算和应用。分子理化属性属于AQbD的知识空间的重要组成部分，是进行方法开发必须要做的工作，接下来我们就进行课程内容的讲述，我们讲一些原理和应用。要向大家说明的是，本系列讲座的内容将向ACD/Labs的用户提供以及放置到识林平台。只有部分章节的演讲内容向非用户提供。本节内容受到大家的欢迎，因此向大家免费提供。

本期的内容由ACD/Labs的应用工程师李丹和我一起准备，今晚由我来向大家讲授。

今天的主要内容分为三节，第一节是简单介绍logD和反相色谱保留行为之间的关系。第二节着重介绍logD与pKa之间的关系。第三节是案例分析。

首先我们用施耐德疏水方程描述物质的保留行为。简单的说物质在色谱柱保留的能力来自于物质与色谱柱的相互作用力。这些作用力可以细分为疏水作用力，体积排阻效应，氢键作用力，离子静电作用力，π-π作用和偶极作用。π-π作用和偶极作用可以认为是分子结构片段的基团的部分电荷分布和色谱柱固定相上部分电荷分布在互相靠近到一定程度后而产生的电场作用，作用力的大小没有离子化基团的静电作用力那么强烈，但在某些物质的保留上扮演着重要的角色，而且由于能力特殊，能提供基于部分基团电荷分布差异带来选择性，因此在2005年被补充进入了施耐德的方程式中。施耐德方程既有溶质保留因子，同时又用乙苯（EB）作为标准物，用乙苯保留因子作为分母，所以还带有选择性的意味在其中。

通常我们表征物质的疏水性的时候，教科书是以logP为表征的。初期研究logP时所用的化合物都是中性的，用的条件也是在pH=7测量的。我们日常工作拿logP作为指标参数来进行分析方法开发时的疏水性评估时，如果评估不电离的物质问题不大，如果评估有可电离基团的分子会发现有问题了：可电离的物质的疏水性会随pH变化而变化，只要物质从分子态转化为电离态，不论电离后带有何种电荷，其疏水性就会下降。因此最好用logD这种pH依赖的疏水性参数来表征分子的疏水性随pH的变化的情况。

pKa是电离常数的负对数。为了统一，酸性基团和碱性基团都用pKa来描述。对于酸性基团，pKa低时表示基团酸性强，pKa高表示基团酸性弱。对于碱性基团用其质子化后的带电状态作为其酸状态，这个”酸”能解离成质子和分子态，因此一样可以用pKa来描述。对于碱性基团来说，pKa越小，碱性越弱，pKa越大，碱性越强。

借用刘国柱博士的一次实验的数据，我们来说明一下logD与反相保留行为的相关性。首先，从这个化合物的结构上我们能识别出有一个较强的碱性基团和一个较弱的碱性基团，其他的基团并无明显的解离性能。用一个耐碱性的色谱柱对这个物质进行pH扫描，从2扫描到11.3，大约每隔1一个pH单位跳跃一次。结果发现在低pH情况下，保留时间相对稳定，而且峰形不太好，碱性化合物在酸性条件下，完全电离后色谱峰峰形有超载现象，这个问题不是我们今天讨论的内容，后续还有专门的章节讨论。我们着眼点就放在保留时间的变化上，随着pH的升高，保留时间变化很快，中间的四个pH值下，保留时间急剧变动，pH再升高到更高的碱性条件下时，9.2，10.2，11.3的pH值下物质的保留时间又进入稳定期，不再受pH的调控发生变化，分子的峰形也非常的好，显得柱效很高。碱性化合物处于分子态时不受电荷带来的影响。

在pH-logD图上，物质在不同的pH水平的logD读数能和C18柱上的色谱保留时间产生对应关系。前三个低pH值对应的logD读数都在一个比较低的水平平台上，后三个高pH值下物质的logD读数都在比较高的水平平台上，这和低pH和高pH时保留时间稳定对应。中间4个pH值下的logD读数变化很大，对应保留时间有大的变化。

如我们上面提到过的，疏水性的变化受物质带电荷数量的影响。从结构上说这个分子有三个电离基团，分别是一个强碱性，一个弱碱性，一个弱酸性基团，离子化状态有4种，分别是双正电荷，单正电荷，分子态以及单负电荷状态。在2-11这个范围内，主要是单正电荷和分子态两种情况。当物质完全电离或者完全不电离的时候，疏水性趋于稳定，而物质带部分电荷的时候，疏水性就随pH变动而急剧变化。所谓物质带部分电荷，是指部分物质带电荷而部分不带，但带与不带这两种状态会快速的纳秒级别的互换，不会出现双峰状况。从峰形上来看，强碱性pKa8.0附近的峰形很好。从实际色谱行为上来说，部分电荷状态带来的主要风险是色谱峰的保留时间稳定性变差，而峰形不见得很差，所以我认为pKa±1范围内不能开发方法的所谓“黄金规则”，并无事实依据。

接下来我们再借助一些典型化合物的典型图形来介绍一下logD和pKa的一些有趣的知识。

首先来看一下比较强的酸：苯甲酸的logD图形。这种图形是先高后低，如果在坐标系上的0的水平上画一条虚拟的线段来表征Agilent EC-C18这样的典型的以疏水保留为主的C18色谱柱，那初步可以判断化合物的在典型的C18色谱柱上应选择的pH范围是在2-6之间才会有较好的保留。

如果将苯甲酸pKa和logD曲线的坐标对齐，会发现pKa点的logD也就是疏水性与分子态的疏水性大小相差不大，约为0.3。而logD图上显示的斜率很大的pH敏感区，与pKa的点距离实际较远。

其次再来看一下弱酸：苯酚。苯酚的logD也是左高右低的变化趋势，它的pKa是10，因此，在很宽幅的pH范围之内，苯酚都是分子态，这令苯酚的logD在2-9之间内几乎是一条直线。logD整体几乎都在0以上，所以对于典型的C18色谱柱来说没有保留的风险。

如果将苯酚pKa和logD曲线的坐标对齐，会发现pKa点的logD也就是疏水性与分子态的疏水性大小同样相差不大，约为0.3。

再来看一下强碱：苄胺。苄胺是强碱，它的logD是左低右高的变化趋势，它的pKa也是10，因此，在酸性条件下，苄胺都是带一个正电荷的离子态，这令苄胺的亲水性很强，更愿意待在流动相内而拒绝与C18的疏水性C18链发生吸附。因此苄胺的酸性条件保留的风险是很高的，等到pH变的足够大，分子态的苄胺比例足够高的时候，苄胺才会有较好的保留。此时pH已经上升到了较高的水平了。因此一般在酸性条件下，要调节增大完全正离子化苄胺的保留，可以采用添加无机离液剂，添加离子对试剂，使用离子交换+疏水的色谱柱，当然一些亲水性的色谱柱也能对苄胺有所保留，但保留时间会比较小。

如果将苄胺pKa和logD曲线的坐标对齐，会发现pKa点的logD也就是疏水性与分子态的疏水性大小同样相差不大，约为0.3。

最后来看一下弱碱苯胺，虽然苯胺在酸性条件下也有在C18色谱柱上保留变弱的困扰，但这个困扰没有苄胺分子那么严重。因为苯胺的pKa在4，5之间，所以其先低后高的曲线在较低的pH下就会出现。

同样，对齐坐标后，会发现pKa点的logD与分子态的logD约差为0.3。显然这个0.3是有规律性的。由于纯离子态时物质的疏水性很低，疏水性与分子态相比相差1000-10000倍的水平，因此计算50%电离态的疏水性时可以快速换算，用100%分子态的疏水性减去log0.5，log0.5约等于0.3。其他百分比的logD大小都可依次计算得来，从而在0-14的范围内绘制出logD曲线。

简单的logD曲线即可照此绘制，而多个电离点的logD曲线则需要复杂的处理方式，有时物质同时存在强酸强碱基团，比如氨基酸类，是不存在分子态的，计算起来就复杂多了。

东阳光的栾保磊老师在最近的方法开发策略的相关的讲座上的这个四象限的图非常有意思，为我们解决峰形和分离的问题提供了思路。要想获得峰形好且分离好的成功结果，一定要学会如何从其他失败空间里通过控制性因素的变化，进入到成功的空间。当然如果峰形不好分离度也不好，早点放弃另觅它法也是应该的。我在这个四象限图它的外面增加了一个保留失败空间，不保留或者过强的保留，都会令液相方法进入失败空间。通常筛选和优化后的方法保留因子最好能够分布在2-10之间，如果组分众多保留因子也可分布在1-20之间。

当把刚才的四个化合物的坐标绘制在一个pH-logD坐标系内，我们会很快识别出风险：logD数值过低有不保留的风险，logD数值过大有保留强的风险。

在logD=0绘制一条虚拟的线作为阈值，作为典型C18色谱柱的保留能力的体现，这里用一根典型C18色谱柱ODS-3来示意。此时可以看到这些曲线在2-10这个范围之内总有在阈值线之下的，也就是说，普通的C18对这四个化合物的同时保留存在一定的困难，单纯靠色谱柱的疏水保留能力是不足的。

为了增大保留，可以更换合适的对亲水性物质保留能力更强的色谱柱。比如这里举了T3色谱柱，这种色谱柱有极性嵌入或者可能还有极性封端的技术，在疏水保留能力之外，增加了氢键保留等的能力。这个-2这个阈值也是一个经验阈值，事实上pH对色谱柱的保留能力也有很明显的影响，不可能是一条直线，而更可能是条曲线。

亲水性强的物质既有中性的也有带电的。氢键能力强的色谱柱对中性的同样含氢键供体受体丰富的物质的保留增强的效果好，对因为带电荷而保留差物质的效果可能就没有那么强了。这时候可以使用一些添加剂来改变保留能力。比如使用磺酸盐和季铵盐有机离子对试剂来增大保留，这种有机离子对试剂很容易在色谱柱上残留而改性色谱柱，因此是最不推荐的。其次可以用兼容质谱的含氟的短链酸的弱离子对试剂，比如二氟乙酸，五氟丙酐，七氟丁酸是常用的增大碱性化合物保留可以兼容质谱的添加剂。最近这段时间来，像华海药业的李敏老师以及刘国柱博士向我们介绍了可以显著增加带正电的碱性化合物的保留甚至还能修饰碱性化合物超载的峰形的无机盐，这些无机盐一般被称为离液剂，其增大碱性化合物保留的能力各有不同，其优点是可以使用梯度。

因此在进行液相分析方法开发之前，对目标物质的保留能力进行预估，对自己手边常用的色谱柱进行保留能力上的了解就很有必要。了解的越多，知识越丰富，就减少落入失败空间的次数。在本页的最后有一个有关物质的logD和对应液相分析方法的应用策略。从离子交换，离子对，到HILIC,正相，再到反相和非水反相，基于物质的性质选择合适的方法，是合理分析方法开发设计的基础。

接下来我们进入案例分析部分，我准备了很多有趣的案例和诸位分享一下我的所得。

在本例中，我们看到的分子是地塞米松的结构，以及其logD和pKa的情况。地塞米松的基团的电离性很弱，一般被制备成醋酸酯或者是磷酸酯。地塞米松属于甾体化合物，其五元环附近的侧链基团容易发生多种降解，因此地塞米松的有关物质数量众多。这些降解产物绝大多数也都是中性化合物，保留没有风险，方法开发时pH不是一个关键性的参数。应注意对色谱柱以及强洗脱有机流动相的种类和比例的选择性加以全面的研究，如果计划控制的杂质数量很多，可能会用到混合有机相。

硝苯地平是一个典型的弱碱性的化合物，结构中只有一个电离性能很弱的碱性基团，pKa大小只有1.9。因此在普通C18色谱柱上保留比较强。

缬沙坦是这几年的搅动风雨的药物分子。它有明显的强电离的羧基基团，也存在第二个强电离基团四氮唑，四氮唑虽然含有很多的氮原子，但是它是羧酸的电子等排体，事实上也是一个强酸。它容易丢失一个质子变成负电荷状态，而很难获得一个质子带上正电荷，因此四氮唑是不可能和亚硝酸反应而成盐或脱水形成亚硝酸类高风险杂质的。缬沙坦在分子态时保留强，pH增高后，出现双负电荷状态，其疏水性下降的会很快。如果把缬沙坦和硝苯地平做成复方，估计合适的pH应当锁定在低pH的范围，而不需要去研究中性和高pH范围，因为缬沙坦会在那个pH范围内不保留。

罗库溴铵的有关物质开发比较困难，因为这个物质的结构上有季铵永久正电荷，还有叔胺这种碱性比较强的基团，pKa6.5。其疏水性在碱性条件下最高点在0左右，所以C18色谱柱往往保留困难。药典方法里是用了Hilic模式进行在中性条件下进行研究，中性条件下硅胶颗粒表面的硅醇基电离后带负电荷，能够和正电状态的罗库溴铵分子有离子交换。药典方法里还需要增加一些四甲基铵类的添加剂，才能真正让罗库溴铵有一个合适的k，这令方法本身的重现性很差。如果单纯用杂化颗粒柱在高pH进行梯度研究，即使色谱峰的保留尚可，峰形也可能因为永久电荷的问题而不佳，可以考虑用离液剂以及阳离子交换加疏水作用的色谱柱进行研究，也可以用有机离子对试剂。从个人经验来说，对于有永久电荷的碱性化合物，往往用阳离子修饰硅胶表面的色谱柱会比较有效，它能提供静电斥力。

精氨酸是典型的亲水性的化合物，结构里既有强酸性的电离基团也有两个强碱性的电离基团。因此这个化合物在0-14的pH范围内是没有分子态的存在的。那什么时候疏水性最强呢？就是在等电点附近，此时结构上的胍基带一个单位的正电荷，羧基带一个单位的负电荷，氨基不带电荷，总电荷为0。此时的logD的读数为-2左右，单纯靠疏水性保留这个物质基本不可能了，亲水性色谱柱有可能性，但耐强碱的亲水性的色谱柱可选的很少。因此精氨酸如果不做衍生化分析，一般都是在强酸性条件下，用离子对试剂来增大保留。当然也可以尝试使用离液剂以及现在开始热门流行起来的混合模式色谱柱。

下面讲一些特殊的例子，就是计算logD明明很低，低过了一般的阈值，但是在亲水性色谱柱和普通C18色谱柱上依然还是有保留。比如这个葡萄糖构成环糊精衍生物舒更。这个化合物的结构很特别，是我们刚刚讲过的罗库溴铵这个肌松剂的拮抗药物。它的仿制药物刚刚有几个国内大厂通过了一致性评价，听说难度挺大的，很多知名企业的申请都被否了。从logD的图形上看，当化合物处于分子态，也就是8个羧基不电离的时候，化合物的疏水性logD能够到-7.0的水平。然而由于结构特殊，这个化合物在C18色谱柱和亲水性色谱柱上都能有保留。而在亲水性的色谱柱上峰形明显比C18的色谱柱好，估计亲水性的色谱柱能够形成水层，能够让舒更分子的作用模式单一，不出现多种吸附模式，从而峰形优秀。结构上明显的发色团是8个羧基，因此吸收比较低，不太合适含有羧基的缓冲体系，因此分析方法往往就是酸性条件下，磷酸调pH，乙腈为强洗脱在AQ类色谱柱上进行梯度或者等度的研究。其他的空间的探索往往都是不成功。

万古霉素也是另外一个logD读数很低，但是在C18色谱柱上有保留的有机分子。这种分子结构大，构象复杂，存在有大量的氢键供体和受体，也有容易电离的基团，因此作用力多样化，其保留不是疏水性的贡献。但在进行有关物质研究时，有关杂质丢失了甲基或者其他的取代基时，保留时间也符合疏水变动的趋势，因此是logD绝对值的辅助判断功能失效，而相对值依然有效。

接下来我们对这5个磺胺类的药物进行分离策略的选择和判断。这5个化合物的结构磺胺部分的结构是一致的，都含有苯环上的弱碱取代，以及存在相同的弱酸性的磺胺，差异在于左侧的取代基各不相同，显然这些差异目标是为了获得更好的成药性。

从叠合图上来看，有明显的红色区和绿色区。红色区在酸性和中性pH范围内分布，这表明有某个化合物的表观pKa，也就是最强酸性和最强碱性基团在这里分布，而且连接成了片。绿色区则没有pKa的分布。从logD的读数上来看，酸性范围内的保留没有问题，而碱性条件下则读数都很低，保留很有问题。显然这时候不需要多做思考，应该在酸性到中性条件下进行研究，没有保留什么都是空谈，至于什么pKa±1范围就顾不得那么多了。在这个范围内有logD曲线交叉的现象，这表示物质是存在共流风险的，pH可以作为一个重要参数调控保留时间，应在这个范围内对pH做充分的研究，至少应该做3个取点的实验。由于化合物带电，所以应当使用缓冲盐调pH，而且应保证有缓冲能力，由于结构中存在苯环和芳香杂环，吸收不会低，因此可以用甲酸乙酸这些羧酸类的缓冲盐。对于强洗脱的种类，目前无法确定甲醇乙腈的选择性的优劣，而且波长都无限制，则都应筛选。在图上pH2到7的范围内五个化合物的logD大小分布都比较接近，因此事宜用一个比较缓的梯度，避免用陡梯度，以避免五个物质的k被挤在一起，看不出选择性。

再举一个原料同分异构体的研究的例子。这7个已知结构中，1，3，4是氟原子取代的位置异构体。2号化合物是弱碱性化合物，5号化合物是弱酸性化合物，其余的都基本为中性分子。

logD的叠图上并没有显示出那么多条线段，显然某些物质的疏水性趋于一致。施耐德的方程式也告诉我们这些化合物的其他性质，体积，氢键等等一定也有所不同，疏水性上有趋同的风险也许可以用其他的能力进行分辨和选择。这时候就适宜使用空间和氢键作用的强的色谱柱，比如苯基柱，氟苯基柱等等进行筛选。pH除了对酸性和碱性化合物有选择性影响之外，其他并无显著影响，因此pH可以优先选择酸性或者中性。中性化合物，苯环异构体分析，氢键选择性，这些因素都会指向使用甲醇作为强洗脱，因为甲醇和水的氢键能力都很强，两者相加使用，效果会比乙腈和水的混合使用效果强。但不应该抛弃乙腈，完全可以在用甲醇作为筛选时的流动相对色谱柱的选择性进行了判断后，拿出最好的筛选结果，再用乙腈跑一下同样的条件，以期决策的更加完备。当然如果一开始筛选就有自动化条件（比如安捷伦的多色谱柱多流路自动化系统）做全面的实验，那就更好了，理由和论据都很充分。排一个筛选序列第二天来看结果即可。

接下来的这个案例也是一个很有趣的故事。我们的用户在进行保留时间的评估时发现出峰错位的问题。这两个化合物是产物和原料的关系，在普通的YMC色谱柱上按照logD大小的规则似乎是应该是1号物质应该出在2号之前。虽然这个现象可以用1号分子的氢键供体数量明显更多，氢键能力可能改变了保留顺序加以解释。但似乎这个色谱柱的氢键能力没有那么的强大。

我的同事帮我指出2号分子事实上还有互变异构体存在，如果把互变异构体的结构画为2’然后再进行预测，则发现2‘的logD在酸性条件下处于1号分子之下，或可解释保留时间的先后关系了。从图形上来看，这个pH附近两个物质的疏水性关系比较微妙，存在一定共流的风险，当然这也单纯是从疏水性的角度分析的。

此案例并没有物质的结构，上来给各位列举的是各国药典的流动相配置方法。无一例外都使用了庚烷磺酸钠。从logD的数据图形上来分析，有两个物质呈明显的碱性，图型先低后高，但碱性强弱明显不同，另外两个分子都是中性分子，logD平行不波动。碱性化合物酸性条件下因为保留差，我们前文叙述过很多可以采取增加保留的方案，离子对试剂是最差的一种。更换成能够使用梯度的高氯酸盐，一样可用，从而可以去除离子对试剂的各种负面效果。

本案例是亲水性的维生素的保留和分离的研究。这些物质保留堪忧，logD的读数都很低。结构中有吡啶类弱碱，也有强酸羧基的存在。

Waters Atlantis dC18亲水性色谱柱+千分之一TFA弱离子对试剂能够将这样的物质保留和分离，其主要的效果实际上来自于TFA.千分之一的TFA能够将pH控制在1.8-1.9的水平，此时能够控制羧酸处于分子态，以TFA增大带正电的吡啶基团的保留效果。

广州菲罗门提供的方案是阳离子交换加疏水作用的Comixsil RP-100色谱柱，用千分之2.5的磷酸控制pH，相当是把原来存在于流动相里的离子对试剂，固定在了固定相上，固定的肯定不是TFA，而是某种基团，这种基团应该电离性比较强，这样才能提供和TFA近似的阳离子交换的能力。把原来用的添加剂的能力转移到色谱柱上，增加色谱柱的保留能力和特殊的选择性，这些都是非常棒的发展趋势，实际上降低了方法开发的复杂度，建议大家多多加以尝试和学习，而不必心存畏惧。使用的时候一定要注意分辨好目标物质的带电形况以及色谱柱的带电情况，以适当的柔和的条件来使用色谱柱，确保既达到目的又令色谱柱经久耐用。

本案例也是一个关于离子对使用时控制pH，控制目标分子电离化状态的案例。一开始保留失败是因为选择在了等电点附近，也就是pH=5附近使用离子对试剂。在等电点附近，化合物的反相保留会最好，但是如果在这个水平上添加了庚烷磺酸钠离子对试剂后，增加了对两个阳离子的吸附能力，但是物质的两个阴离子就没有阳离子中和了，而且庚烷磺酸钠还会对负电荷生斥力，保留没有改善。采取和上面的例子一样的策略，将pH值调低到2附近，令羧基尽量处于分子态，再用庚烷磺酸钠试剂，甚至抛弃掉庚烷磺酸钠而用高氯酸钠离液剂来增大保留，调pH的酸可以考虑用千分之一二的磷酸。

本案例是奥司他韦有关物质研究时的发生的有趣的故事。对于奥司他韦的两个杂质，混标进样后一前一后出峰。其流动相为千分之一的三乙胺用磷酸调节pH到5.8，B相为甲醇。但如果对样品进行杂质加标研究时发现两个杂质的保留时间变化很大，1号峰位置向后靠近了奥司他韦主峰，2号峰出在奥司他韦主峰的后面，露出一个肩峰。在多根C18色谱柱上都出现了这样的问题，但是在C8色谱柱上这个问题就没有。

对目标物进行研究，奥司他韦，典型的碱性化合物，疏水性先低后高。

杂质1疑似奥司他韦和柠檬酸的酰胺化产物，可能是个降解杂质。这个杂质没有碱性电离基团，但有两个强酸性的基团。logD图形是先高后低的。

杂质2比杂质还多了一个亚甲基，因此logD的酸性疏水性的平台要显得更宽一些，整体疏水性显然要增大一些。

将这三个物质放到一个坐标系进行比较，在pH 5.8 条件下，C18色谱柱应该是给出杂质1，2最后奥司他韦得出峰顺序，但是其真实的出峰顺序很类似于pH 5.0附近的情况。

由于方法的pH5.8 距离磷酸盐的第二个缓冲区边界6.0 还有举例，因此略微加一点酸液进去，pH就会急剧变化。奥司他韦由于制剂为磷酸盐，因此样品溶解后自然解离出磷酸。这点磷酸就可以改变流动相的pH，从而改变物质的保留。

C8色谱柱一样会面临pH的变化，但为什么它的抗性更强呢？杂质的保留时间还是有所变化，但的确没有C18变化的那么剧烈。

猜想其原因来自于C8色谱柱的氢键和离子交换作用更加的明显，具有一定的抗性。而C18色谱柱的主要作用力就是疏水作用，保留能力的变化与图形上的结果对应得更好。

总起来说，如果pH没有缓冲能力，对于离子化的物质的保留就会失控，环境的微扰就能带来保留时间的快速变化，方法因此而不耐用。这样的知识，我们将放到第五节课来讲述。

我们来总结一下此次课程的内容。对于logD的认识，帮助我们进行保留风险的评估，帮助我们基于物质的特性选择合适的液相方法策略，在合适的设计空间内进行筛选，减少进入失败空间的几率，降低试错成本。在优化阶段，如果研究对象是电离化的，那要仔细研究pKa以及pH的关系，让分析方法更稳定和可靠。在logD变动区研究，要对物质保留变动的风险有充分的认识。在使用离子对试剂，离液剂以及离子交换疏水混合模式色谱柱时，必须对电离化的目标物的电离程度，带电种类和数量有充分的认识。否则很容易被分析方法打败。

对后续的课程进行一些预告。课程有两节（5月23、25日），会讲到色谱知识和色谱行为以及色谱柱的知识，分别由陈诚和我来讲解。这张片子属于剧透：电离完全的碱性化合物在酸性条件下如果不加以主动的干预，在普通的色谱柱上会出现超载，超载峰多为直角三角型，或称为L型。这是因为解离后的碱性化合物的超载质量远远低于它的无电荷中性状态，在碱性条件下峰形好，而在酸性条件下一点点的量也可能超载。