Nature旗下CDD| 武汉大学人民医院首次发现CLDN4蛋白在恶性胶质瘤中的调控机制

吉凯基因

2022.6.22

作者吉凯基因

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Claudin蛋白家族通常位于细胞膜的顶端区域，能够形成紧密连接（TJs）复合物，用于维持细胞间粘附、维持细胞极性和选择性细胞旁通透性。Claudins蛋白家族成员的过度表达或缺乏表达在慢性炎症和恶性肿瘤等疾病的病理过程中起着关键作用，其中Claudin-4（CLDN4）是Claudin家族的重要成员。

有研究表明，胃癌中的CLDN4可增强胃癌细胞的增殖，侵袭和上皮-间质转化（EMT），并被miR-596和miR-3620-3p逆转。同样，CLDN4的过表达后，可通过PI3K/Akt和EMT转录因子Twist1信号通路，诱导卵巢癌细胞EMT。然而，CLDN4在恶性胶质瘤（GBM）中的生物学作用仍然未知。

2022年4月武汉大学人民医院神经外科陈谦学主任和田道锋主任在《Cell Death & Disease》（影响因子8.649）上发表了题为“TGF-βinduces GBM mesenchymal transition through upregulation of CLDN4 and nuclear translocation to activate TNF-α/NF-κB signal pathway”的文章，首次在胶质瘤中发现了CLDN4/TNFα/NF-κB信号轴，破坏该信号轴的功能可能是治疗恶性胶质瘤患者的一种新策略。

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研究概要

CLDN4是基于癌症基因组图谱（TCGA）确定的与神经胶质瘤进展相关的基因。通过TCGA数据集进行Kaplan-Meier分析，发现CLDN4与胶质瘤的总生存期（OS）密切相关，提示CLDN4对胶质瘤患者预后的预测价值。我们的结果显示CLDN4在胶质瘤标本和细胞中显著上调，CLND4表达的抑制可以在体外和体内抑制间充质转化，细胞侵袭，细胞迁移和肿瘤生长。CLDN4可以调节肿瘤坏死因子-α（TNF-α）信号通路。TGF-β信号通路能够促进CLDN4的核转位，调节CLDN4的表达。下调CLDN4，并且与ITD-1联合治疗可以获得更好的治疗结果。总之，研究结果表明TGF-β/CLDN4/TNF-α/NF-κB信号轴在胶质瘤的生物学进展中起关键作用。破坏该信号轴可能代表GBM患者的新治疗策略。

研究结果

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1. CLDN4在胶质瘤组织和细胞中高表达

CLDN4在癌症基因组图谱（TCGA）高级别胶质瘤中高表达。Kaplan–Meier分析表明，CLDN4的表达与OS和DFS呈负相关。在我们的研究中，CLDN4在恶性胶质瘤（GBM）组织中的表达高于邻近正常组织。与低级别胶质瘤脑组织相比，GBM患者中CLDN4的表达最高。与正常人星形胶质细胞系（NHA）相比，GBM细胞系中CLDN4的表达显著增加。这些结果表明CLDN4在胶质瘤中表达增加，与预后呈负相关。

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2. CLDN4过表达能够促进GBM细胞的增殖，迁移和侵袭能力

为了进一步研究CLDN4对GBM生物学行为的影响，在U87细胞和LN229细胞系中建立了沉默和过表达模型。与对照组相比，CLDN4敲低显著抑制细胞增殖，迁移和侵袭。相反，CLDN4的过表达促进了细胞的增殖，迁移和侵袭。过表达的CLDN4也显著增加了间充质相关基因的表达。这些结果表明CLDN4过表达能够促进GBM细胞的增殖，迁移和侵袭，并且对于维持GBM的间充质特性是必需的。

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3. 下调CLDN4后对GBM细胞进行蛋白组学分析

对TCGA数据库中544例 GBM患者的测序结果进行分析表明当CLDN4表达下调时，TNF-α途径相关基因的表达显著下调。为了进一步了解CLDN4在GBM细胞中的作用，在U87MG细胞中下调CLDN4，并使用吉凯基因的4D label free技术进行蛋白组学分析。结果显示，当敲除CLDN4时，615种蛋白质被上调，467种蛋白质被下调。与CLDN4表达相关的差异表达蛋白的GO分析表明，CLDN4的下调主要与细胞粘附和TNF-α信号通路有关，这与TCGA数据库的生物信息学分析结果一致。因此，TNF-α分子通路可能是GBM中CLDN4致癌过程的潜在重要特征。

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4. CLDN4可以调节TNF-α诱导的NF-κB活性

以前的研究表明，TNF-α通过激活IKK复合物来调节NF-κB信号通路。进一步的研究表明，TNF-α以时间依赖性方式增加NF-κBp65水平，能够诱导GBM细胞的间质转化，增强GBM细胞的迁移能力。CLDN4能够调节TNF-α诱导的NF-κB活性。

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5. TGFβ1可促进CLDN4核积累

CLDN4 mRNA取决于TGFβ或ITD-1（ITD-1可以阻断TGFβ2诱导的P-Smad2/3）的处理，揭示了经典的TGFβ信号通路可以参与CLDN4表达的调控。研究发现TGFβ1促进CLDN4进入细胞核，而ITD-1起相反的作用。同时通过免疫荧光分析，TGFβ1和ITD-1分别逆转shCLDN4和CLDN4OE中细胞核CLDN4的表达。以上结果表明，核转位机制可能是调节CLDN4表达的主要途径。

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6. 敲低CLDN4显著抑制肿瘤生长

为了进一步研究抑制CLDN4表达对体内GBM进展的抗癌作用，通过颅内注射荧光素酶标记的CLDN4 NC或shCLDN4 U87细胞建立异种移植模型，将其直接接种到裸鼠侧脑室。在异种移植后6天进行ITD-1治疗，并且每天重复三次。研究表明，shCLDN4+ITD-1组的异种移植肿瘤体积显著减少，GBM的肿瘤发展受到抑制，总生存率也高于其他组。异种移植肿瘤的Ki67染色结果显示shCLDN4+ITD-1组的Ki67阳性率显著降低，表明CLDN4敲低可抑制GBM肿瘤的进展。最后，我们提取异种移植蛋白，发现shCLDN4+ITD-1组显著抑制GBM细胞的间充质转化。因此，这些结果证明CLDN4的稳定下调抑制了异种移植小鼠胶质瘤的生长和侵袭，并且与ITD-1联合治疗可以获得更好的结果。

总结

此项研究首次发现CLDN4在GBM组织和细胞中上调。CLDN4高表达的患者总生存时间较短。CLND4表达的抑制可以在体外和体内抑制间充质转化，细胞侵袭，细胞迁移和肿瘤生长。CLDN4 诱导GBM 细胞间质转化是通过调节 TNF-α介导的NF-κB 信号通路。在另一方面，TGF-β/smad2 信号通路可以调节CLDN4 的表达和核转位。总之，研究结果表明TGF-β/CLDN4/TNF-α/NF-κB信号轴在胶质瘤的生物学进展中起关键作用。干扰这个信号轴的功能可能是GBM患者的一种新的治疗策略。

吉凯助力

该研究中的4D label free蛋白质组和慢病毒产品均由吉凯基因提供。

作者简介

武汉大学人民医院神经外科陈谦学主任和田道锋主任为本文共同通讯作者。鄢腾峰博士为本文第一作者。

鄢腾峰博士

吉凯基因凭借多年在靶标筛选及验证服务领域的技术积累，建立的标准化、工程化、系统化的GRP平台，为中国研究型医生提供科研服务，加快科研成果转化。其中，多组学平台包含蛋白质组学平台和高通量测序平台：

·蛋白质组学平台拥有多台timsTOF Pro、Exploris 480高精度质谱仪，专业领先的Spectronaut Plusar、Mascot等分析软件，提供专业的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修饰组、olink蛋白质组等检测服务，强大的机器学习算法、IPA分析、蛋白基因组分析服务，系统的生物标志物、分子分型、药物靶点、基因功能研究等解决方案，真正让广大研究型医生的科研工作更省心、更省力、更高效；

·高通量测序平台分为常规测序服务和单细胞测序服务：单细胞测序拥有10x和BD两个平台，提供单细胞RNA-seq、单细胞核测序、单细胞混样RNA-seq、单细胞TCR/BCR、单细胞（RNA+ATAC）、空间转录组测序等服务；常规测序服务提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修饰测序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修饰测序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻译组测序）、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全转录组测序（两文库/三文库）、外泌体miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服务。