01
著名免疫实验室如何使用高内涵
进行中和实验：
根据《病毒学实验》书中的介绍，中和实验（Neutralization Assay）是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将病毒与抗体混合物接种到敏感的宿主细胞内，然后测定残存病毒的一种方法，是病毒学经典方法之一。多年来有不少免疫学家和病毒学家将新兴的高内涵成像分析技术应用到传统病毒学检测领域，形成一套成熟灵敏可靠的高内涵病毒监测方法，即高内涵病毒中和实验。Michel C. Nussenzweig 是众多使用高内涵的学者之一，他是洛克菲勒大学免疫学教授，HIV 研究者，美国人文与科学院（AAAS）及美国科学院（NAS）院士，其团队在 HIV 和 COVID-19 领域贡献卓越，发表过大量优质文章。
本文挑选两篇他的团队在 Nature 上发表的 COVID-19 文章，来探讨世界知名团队如何采用高内涵技术帮助其加速研究发现。
我们正处在 COVID-19 大流行，SARS-CoV-2 已经夺去了数百万生命。著名免疫学家 Michel C.Nussenzweig 及其合作者 Davide F. Robbiani，Frauke Muecksch 等在新冠大流行早期在 Nature 上发表了名为《 Convergent Antibody Responses to SARS-CoV-2 in Convalescent Individuals 》的文章，这篇文章对疫苗开发和后续 SARS-CoV-2 研究起到了重要作用。
2020 年我们对 SARS-CoV-2 的抗体反应知之甚少，他们的团队收集了 149 名 COVID-19 康复者的血清进行研究。这些血清收集于患者症状发生后平均 39 天，他们发现这些样品具有宽范围的病毒中和滴度：33% 样品小于 1:50 ，79% 样品小于 1:1000 ，而只有 1% 的滴度大于 1:5000 ，这显示从 COVID-19 康复者身上获得的大多数恢复期血浆含有高水平的病毒中和活性。并且，在所有测试的个体中都发现了具有强效抗病毒活性的罕见但反复出现的 RBD 特异性抗体，这表明此类抗体可能也具有广泛的有效性。
为了确定这些抗体的中和活性，研究者们首先对它们进行了针对 SARS-CoV-2 假病毒的测试。在测试的 89 种 RBD 结合抗体中，他们发现 52 种可以中和 SARS-CoV-2 假病毒，其半数最大抑制浓度（IC50）为 3-709 ng/ml 。
ELISA 实验筛选结合 RBD 的抗体。
随后选取这些抗体中最有效的一批，针对活的 SARS-CoV-2 活病毒进行了基于高内涵技术的病毒中和实验，其结果如下:
左：SARS-CoV-2 活病毒中和实验，以感染细胞数做均一化;
右：不同抗体活病毒和假病毒 IC50 对比。
文章描述的基于高内涵的抗体中和实验具体方法如下：感染前一天，将 Vero E6 细胞以 12500 个细胞/孔铺到 96 孔板中。抗体在 BA-1 中连续稀释，并与恒定量的 SARS-CoV-2 混合，在 37°C 下孵育 60 分钟。然后将抗体-病毒混合物加入 Vero E6 细胞，感染后 18 小时，通过向孔中加入等体积的 7% 甲醛固定细胞，然后用 0.1% Triton X-100 穿孔 10 分钟。充分洗涤后，将细胞在室温下与 5% 山羊血清的 PBS 封闭溶液一起孵育 1 小时。将兔多克隆抗 SARS-CoV-2 核衣壳抗体以 1:500 与封闭溶液稀释并添加到细胞中，然后在 4°C 下孵育过夜。以 1:2000 稀释的山羊抗兔 AlexaFluor 594 作为二抗，细胞核以 Hoechst 33342 染色，使用 ImageXpress 高内涵进行成像分析。可见其实验步骤为经典的免疫荧光方法，这种方法成熟且特异性高，在高内涵实验中尤其常用。
通过一系列实验结果，作者们证明了人体上能够产生抗 RBD 的能够中和 SARS-CoV-2 的抗体。因此，选择性和有效地诱导针对 SARS-CoV-2 的 RBD 的疫苗可能会有效。
但是 COVID-19 大流行并没有如愿结束，由 SARS-CoV-2 引起的 COVID-19 大流行在其开始两年多后仍然难以控制。尽管已经有几种有效的疫苗可供使用，但由于出现了似乎更具传染性和更能突破疫苗的变体，控制大流行的进展放缓了。
为进一步研究注射抗体后新冠的新变化，Michel C.Nussenzweig 团队 Zijun Wang 等人在一年多以后又在 Nature 上发表了重要文章 《Naturally enhanced neutralizing breadth against SARS-CoV-2 one year after infection》，并证明了随着时间的推移，表达广泛和有效抗体的 B 细胞克隆被选择性地保留，并在接种疫苗后显著扩增。这些研究者们在文章中报告了他们研究了在 SARS-CoV-2 感染后 1.3 , 6.2 和 12 个月的一组 63 名从 COVID-19 康复的病人，其中 41% 的人接种了 mRNA 疫苗。最终结果表明，血液中和抗体活性降低很多，但是特异性记忆 B 细胞的数量保持不变。成功证明了感染 SARS-CoV-2 后通过 mRNA 疫苗接种产生的血清学反应和 B 细胞记忆显著增强，而且接种疫苗的恢复期个体可对新出现的变异体享有高水平的保护。
文章中依旧采用与前一篇文献相同的免疫荧光方法进行活 SARS-CoV-2 病毒中和实验，仅做了些许优化：感染前一天，以 10000 个 Vero E6 细胞每孔细胞铺 96 孔板。稀释的血清和抗体与 SARS-CoV-2 的 WA1/2020 或病毒 B.1.351 变种混合，并在 37°C 下孵育 1 小时。然后将抗体-病毒混合物直接加入 Vero E6 细胞中并在 37°C 下孵育 22 小时，随后通过向孔中添加等体积的 7% 甲醛来固定细胞，然后用 1% Triton X-100 穿孔 10 分钟。洗涤后，将细胞在 37 °C 下与 5% 山羊血清的 PBS 封闭溶液一起孵育 1 小时。将兔抗 SARS-CoV-2 核衣壳抗体以 1:1000 稀释在封闭液中并加到细胞中，在 4°C 下孵育过夜。山羊抗兔 AlexaFluor 594 以 1:2000 的稀释度用作二抗，细胞核用 1 μg/ml 的 Hoechst 33342 染色，然后使用 ImageXpress Micro 高内涵进行成像分析。所有实验均在生物安全三级实验室进行。可见由于方法已经非常成熟了，所以此篇文献仅对原方法进行了些许改变。
02
高内涵病毒中和实验优点分析：
对于中和活性的检测，除成像方法外，还有 ELISA，Reporter 等方法，这些方法有成本低，通量高的优势，所以上述研究者们以这些方法对大量抗体使用假病毒为目标进行初筛。但为什么世界知名科研团队最终会选择高内涵成像分析技术来执行重要的活病毒中和实验呢？
首先，如文章所示，活病毒中和实验采用免疫荧光（IF）方法，其具体步骤为：先用病毒特异性抗体结合病毒，并以荧光二抗结合特异性一抗，然后使用高内涵成像系统对样品进行成像。得到类似图像：
蓝色：细胞核；绿色：病毒聚集颗粒
随后使用高内涵配套软件控制仪器拍摄分析，可见其步骤并不复杂。除此之外由于使用了特异性抗体，免疫荧光有着特异性高，灵敏度高等传统方法不具备的优势。
其次 ImageXpress 高内涵能够以智能计数的方式来统计结果，这样可以把结果精确到个位数细胞，这种统计方式通常被认为可以提高实验灵敏度，尤其对于那些阳性率较低的实验。分析软件还能额外细胞内病毒荧光，计算含有病毒颗粒的细胞个数/百分比，甚至不同状态细胞的形态学变化等参数，丰富次要实验数据。而且高内涵软件可以根据目标蛋白的聚集方式和表达位置，可以智能排除一定背景和干扰，比如假设蛋白以点状在细胞质中聚集，那么可以通过设定排除细胞核内荧光和排除弥散在细胞质内的荧光，进一步提高实验灵敏度。目前最新的 AI 技术的软件甚至可以设定更精密的算法，更精确的识别病毒聚集颗粒。
此外，基于免疫荧光的方法无需像某些 Reporter 实验那样需要提前对宿主细胞进行改造，省去质粒构建和转染的步骤。并且高内涵系统可支持全面的机械臂和多设备整合，对于病毒或其他高生物安全级别实验室，可方便实现无人化实验，保护实验室人员安全。
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