10 分钟？就能获得检测病毒诱导的细胞病变效应的实验结果？

• 病毒空斑试验

病毒空斑试验是使用最广泛的病毒定量检测方法之一 ⁴  。通过计数不同稀释度下的空斑形成数量可以知道每毫升病毒颗粒数或每毫升空斑形成单位（ PFU  ）。由于每个空斑来自于起初的一个病毒颗粒，因此可以从单个空斑中纯化得到来源于单个克隆的病毒种群。细胞空斑试验对细胞状态要求比较高，而且比较费时。

• 量反应检测法：TCID_{50  ,}  LD_{50   ,}   EID₅₀

病毒空斑试验对于确定病毒滴度非常有用，但是有些病毒在培养时不能形成空斑。这些病毒感染细胞后不会造成细胞死亡，但会让细胞发生细胞病变效应（CPE ），可以用  TCID_{50   ,}  LD_{50  ,}  EID₅₀  等方法进行检测³。半数组织感染剂量  TCID₅₀  是指使一半的单层细胞培养发生细胞病变的病毒量，TCID₅₀  检测法被广泛地应用于流感病毒，人类疱疹病毒，  HIV-1  等各种病毒的试验研究以及临床诊断中。此外，可以通过终点稀释法将病毒悬液感染动物来确定病毒的滴度。如果病毒导致动物死亡或残废，相应的结果可用每毫升半数致死剂量（  LD₅₀  ）或每毫升半数致残剂量（  PD₅₀  ）来表示。

• 免疫荧光检测法

  （ immunofluorescence assay  IFA ）

针对不能形成空斑或者不能导致明显  CPE  效应而无法确定其  TCID₅₀  的病毒，免疫荧光检测法（  IFA ）是一种确定病毒滴度的快速检测方法⁵。IFA  主要利用抗体染色的方法，因此该检测方法成本较高。而且容易由于非特异性结合导致染色背景较高，实验结果不准确。

图 1 Viral ToxGlo 检测工作流程。

• TCID₅₀  测定

病毒感染力和组织培养感染剂量（  TCID  ）的测定可以通过制备病毒原液的系列稀释液，并将这些稀释液添加到目标细胞中暴露特定的时间来确定。在暴露结束时，使用  Viral ToxGlo  可以测定细胞活力的指标  ATP  。TCID₅₀   被用于后续对抗病毒药物效力的研究。在   SpectraMax iD5  微孔板读板机上读取数据，试验设置如表  1  所示。使用 SoftMax Pro 软件中的 4 参数曲线拟合将结果绘制为 RLU 与病毒稀释因子的曲线，并从这些曲线中获得每种病毒在其各自细胞系上的   TCID₅₀   值（图   2  ）。

表 1 使用  SpectraMax iD5 微孔板读板机

进行  Viral ToxGlo  检测的参数设置。

• 复方抗病毒效力的测定

为了评估化合物利巴韦林和瑞德西韦在降低病毒处理细胞的细胞病变效应方面的有效性，将   MDCK   或   MRC-5   细胞接种在培养基中，细胞在培养箱中附着和过夜生长。细胞与病毒和化合物孵育后，将   Viral ToxGlo ATP   检测试剂加入检测孔中，并将微孔板在室温下孵育  10  分钟，使细胞裂解。在    SpectraMax iD5  微孔板读板机上读取发光信号（设置，见表 1 ）。使用   SoftMax Pro   软件中的 4 参数曲线拟合将结果绘制为   RLU  与化合物浓度的曲线，并从曲线中获得每种化合物的   EC₅₀   值（图  3  ）。

图 2  H1N1 病毒在 MDCK 细胞上的浓度-反应曲线（ A ）

和  HCoV-229E 在 MRC-5 细胞上的浓度-反应曲线（ B ）。

图 3  利巴韦林对 MDCK 单独或加入 H1N1 病毒的脱靶 (绿色) 和靶向 (红色) 效应（ A ）。瑞德西韦对 MRC-5 单独或加入 HCoV-229E 病毒的脱靶 (绿色) 和靶向 (红色) 效应（ B ）。利巴韦林  EC₅₀ = 89 µM ；瑞德西韦 EC₅₀ = 215 nM。