多肽原料药质量
多肽原料药质量控制相对复杂，在《制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响》和《合成多肽药物质控及杂质谱研究》中阐述了如何结合保护氨基酸质量控制、缩合过程控制、纯化控制、中间体控制等综合实现多肽类药物的质量控制。
在此需要明确合成多肽药物的过程控制更为重要，是多肽类仿制药申请和一致性评价申请提升质量的重点。
在全面研究的基础上，才可能实现对多肽类药物的充分质控，仅靠检测手段可能无法有效评估产品质量，以下分享2个可能引起多肽类药物质量风险的实例。
对于小分子化学药，合成路线不同造成杂质谱的差异有限，经过相应的分析及研究基本可全面覆盖潜在杂质谱的差异。多肽类药物不同于小分子化学药，其合成路线较多，同一条肽链可以利用固相合成、液相合成、固相液相结合的片段合成等手段制备，即合成路线选择较多，造成工艺杂质与参比制剂存在较大差异。
从目前申报资料上看，国内基本采用从C端到N端逐步偶联的手段制备，而多数国外原研企业采用固相合成制备多肽片段，再偶联成整条肽链。暂且不分析合成路线合理性问题，但不同合成路线可能导致杂质谱存在较大差别。
以美国药典收载的艾塞那肽为例，尽管药典收载的有关物质分析方法多达3种，但有部分申请人开发之后仍发现药典收载方法存在不可检出的工艺杂质。
药典收载的方法可能主要源于原研品方法，由于仿制企业采用的合成路线不同，所产生的杂质谱不一致。仅采用药典或原研进口注册标准的有关物质分析方法可能无法全面揭示仿制药杂质水平，进而导致产品质量存在风险。
因此，对于多肽类药物需进行详细的杂质谱分析并采用相应的杂质对照品对分析方法的检出能力进行全面验证，仅采用已有的分析方法进行考察，很可能造成杂质漏检等质控缺陷。对于杂质含量方面，需要注意某些杂质即便满足安全水平范围，但也可能对多肽药物的稳定性存在较大影响。
比如，某多肽类药物收载于《中华人民共和国药典》，药典对有关物质的要求为最大未知单杂不得过2.0%。
在审评过程中发现按药典收载方法检测，参比制剂主峰后为单一杂质峰，多数国产制剂主峰后存在2个杂质峰，其中1个杂质峰与参比制剂杂质峰相对保留时间相同，应该为同一杂质，多出的杂质峰为新增未知杂质。杂质含量未超过最大未知单杂的控制限度要求。
尽管初始杂质水平较低且符合药典要求，但在稳定性考察过程中，新增的未知杂质增长较快，12个月后已接近控制限度要求，而参比制剂主峰后仍基本维持一个杂质峰。分析该杂质可能是酰胺类水解杂质，在体系内残留的少量杂质可能发生类似“链引发”反应，造成仿制产品的杂质增长水平远高于参比制剂。
结构是基础，如果结构上存在差异，仿制产品的活性可能弱于参比制剂，甚至没有活性。
多肽类药物结构确证与小分子药物存在较大差别，可能具有高级结构，常用可以反映多肽药物结构的方法如下。
一级结构确证方法：可以采用质谱测定其分子量，用质谱结合酶切进行肽序的鉴定，或者采用Edman降解进行肽序的鉴定。
二级结构确证方法：多肽二级结构实际上是肽链因氢键而形成的局部结构，研究手段有X-射线单晶衍射、二维NMR、FT-IR及远紫外CD等方法。其中X-射线单晶衍射及二维NMR测的最为准确，但多肽的单晶不易培养，而且不代表溶液中的真实情况，而二维NMR耗时长、解析困难，并且分析通量低，所以这2种方法一般用得较少；目前采用最多的是FT-IR与远紫外CD法。
三级结构确证方法：对于复杂多肽可能有三级结构存在，三级结构研究常用的方法有荧光光谱及近紫外CD等，其原理是利用芳香氨基酸侧链的微环境变化带来荧光发射光谱和近紫外CD谱的差异。
但该方法目前只能进行定性对比研究，无法进行明确的结构确证，只能作为三级结构研究的参考。
四级结构确证方法：多肽及蛋白功能性聚集是高级结构的一种反映，它包含两方面信息:聚集单体的数量和聚集后的空间构象。常用的分析方法包括场流分离、超速离心。
生物活性研究方法：由于高级结构确证可能存在一定的不确定性，可通过测试生物活性间接证明多肽类药物高级结构的正确性。如表2所统计已收入美国药典的11个多肽类药物有4个制剂和1个原料药需要测定生物活性，越来越多的多肽类药物需要增加生物活性的研究和检测。
目前，对于多肽及蛋白的活性研究有体外(in vitro)及体内(in vivo)2种路径。
in vitro评价方法包括但不限于酶动力学、结合力测定、生物活性测定。其中酶动力学测定采用酶促反应；结合力测定，如果是分子之间采用表面等离子共振技术(SPR)、生物膜层干涉技术(BLI)以及微量差示扫描量热技术(NanoDSC)等技术完成，如果是和细胞表面的受体结合一般采用均相时间分辨荧光等技术完成；生物活性一般采用药物刺激细胞，采用均相时间分辨荧光等技术检测其产生的化学物质来完成。
in vivo评价一般采用动物或动物器官，如机理明确则检测具体某种化合物指标，如不明确则观察具体的治疗效果。例如可采用小鼠的EAE模型来评价醋酸格拉替雷对多功能硬化症的症状延迟及减轻效果。
对于多肽类药物而言，结构确证部分不同于小分子化学药物。小分子化学药物一般在原料药部分明确结构后，制剂开发中可不用进一步研究。而多肽药物由于高级结构的不确定性，部分需要在制剂中与参比制剂进行对比研究，以确定某一结构含量与参比制剂的一致性。
同时，由于多肽类药物高级结构与其所处环境有关，在结构测试过程中可能脱离药物实际使用环境，因此有必要采用多种相互补充的分析方法对比研究仿制品与参比制剂结构的一致性。
在此需要明确，并不是所有多肽类药物都存在高级结构，在合成中存在高级结构的药物仅占少数。在此建议产品开发者先通过参比制剂信息、文献、专利等方面综合检索，明确是否存在高级结构，再选择适合的结构确证手段进行研究，避免过度开发。
辅料选择问题：尽管药监部门允许注射剂仿制药在抑菌剂、缓冲剂、pH值调节剂、抗氧剂、金属离子络合剂等与参比制剂存在差异，但对于多肽制剂而言，所选择辅料应尽可能与参比制剂一致。
主要原因有：肽链的稳定性较差，酸、碱、金属离子等可能引起肽链降解；肽类药物结构中存在多个裸露的氨基与羧基，可能会与辅料相互作用，形成相关的杂质；多肽类药物可能存在高级结构，细微的pH值、离子强度的差异可能引起结构的变化。
配液过程：部分多肽类药物对溶液pH值、氧含量、离子强度等敏感，在配制过程中，短时间脱离稳定环境，会给多肽类药物造成不良影响。
对工艺细节的把握则更加关键，需对原辅料加入顺序、搅拌时间、搅拌速度、是否需要避光除氧等进行详细的考察，确定是否对产品质量造成影响。
如某多肽制剂，前期工艺开发过程中发现该药物在相对较窄的pH值范围内稳定，拟定关键工艺参数pH值控制范围也相对较窄。在首次工艺验证中发现，配液之后pH值在拟定控制范围内，但所制备部分终产品pH值已超出拟定控制范围。
主要原因是批量放大后，商业生产设备的搅拌性能低，多肽类药物的溶解时间延长，药物配置后pH值需在较长时间后达到稳态。对搅拌速度、时间等工艺参数进行详细考察后，实现了连续3批产品的稳定生产。
如某多肽制剂，3批工艺验证产品在12个月稳定性留样时，一批产品杂质增加幅度明显较另2批大，经审查实际批生产记录时发现，变化较大批次产品存在pH值回调问题。由于该产品工艺是将原料药加入调好pH值的溶液中，回调之后体系离子强度增加，初步判断是造成该降解现象的主要原因。
申请人的补充研究显示，如果体系中离子强度增加，加速试验可明显发现药物降解速度增加，因此在工艺规程中进行了严格的限定，如pH值调节失败，直接作为废液处理，重新生产。
冻干工艺问题：多肽类药物受稳定性限制，采用注射给药途径时多选择冻干注射剂。从申报资料来看，多数申请人仅以可冻干为目的开展研究，忽视冻干工艺对稳定性的影响。
由于药物在冻干过程中可能存在缓冲剂结晶、pH值位移、稳定剂形态改变、多肽空间构象改变等诸多问题，进而可直接影响多肽类药物的稳定性。
如某进口多肽制剂，拟定冻干工艺需40℃保持较长时间，由于药物拟定贮藏条件是2～8℃保存，因此在审评过程中对该过程提出疑问，要求申请人进一步提供冻干工艺的合理性。
申请人提供了不同冻干工艺条件下产品稳定性的比较数据，结果显示二次升温阶段采用较高温度时，产品长期放置过程中降解杂质明显少于全程均在低温条件下冻干的产品。
该过程可认为是冻干工艺中的“退火”，可以起到释放药物能量、改善微观结构等作用，进而达到进一步稳定多肽类药物的目的。美国Michael Pikal教授在该方面进行了深入研究，可指导多肽类药物冻干工艺的开发。
特殊包装形式问题：部分降糖药物采用卡式瓶预灌封技术，该类药物由于制备工艺和使用方法的特殊性，需建立特别的研究手段。
如卡式瓶在生产过程中一般需硅化处理，硅化步骤直接影响内壁的光滑程度，进而影响给药剂量的准确性。
应对硅油喷涂量、均匀性等进行相应的控制；由于给药方式的特殊性，如制剂中含有气泡，会导致对压力反应的不一致，直接引起给药剂量不准确，可在灌装过程中采取多次注入的方式以减少气体的引入；该类药物涉及多次刺穿等问题，需对包材密封性进行完整的考察。
相容性问题：部分多肽类药物对生产设备可能引入的金属杂质较敏感，微量杂质的引入可能引起肽链降解，导致仿制品的降解速度快于参比制剂。
开展药物与生产设备、滤器、药物包材的相容性研究时，在小分子化药关注研究内容的基础上，研究者应提高对金属离子等无机杂质的关注度。另外，多肽类药物给药剂量通常较小，为了保证药物剂量的准确性，需要关注生产设备、滤器、包材对药物的吸附，必要时可采用过量投料的方式予以解决，但应提供充分依据。
如某多肽制剂，申请人在前期开发中发现拟定生产设备可引入金属离子，导致产品降解速率明显加快。由于生产设备更换难度较大，申请人拟定配液工序使用一次性配液袋，避免了金属离子的引入，进而保证了产品质量。
专属溶媒、注射器问题：部分多肽参比制剂有专属溶媒、专属注射器具，仿制药企业在开展研究时，需要关注药物是否与临床通用配伍溶媒、注射器存在相容性问题，应充分评估专属溶媒、注射器的必要性。
如特利加压素参比制剂，具有专属溶剂氯化钠水溶液，产品质量标准附录中对氯化钠水溶液中氯化钠浓度和pH值等做了较详细的限定，目前临床通用的配伍溶剂不满足参比制剂拟定控制限度要求。
国内上市的注射用特利加压素均未明确临床配伍溶剂，因此在后续一致性评价等研究中需评估专属溶剂的必要性及配伍使用过程中对产品质量及患者耐受性等多方面的影响。
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