IF=102！蛋白质组学揭示进行性纤维化间质性肺病biomarker，一项多中心大队列研究

迈维代谢

2022.11.15

作者迈维代谢

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●发表期刊：The Lancet Discovery Scinence

●影响因子：102.642

●发表时间：2022.06.18

进行性纤维化间质性肺病（ILD）是一种以实质瘢痕形成为特征的破坏性疾病，导致肺功能恶化和早期死亡。尽管所有特发性肺纤维化（IPF）患者发生了进展，但其他常见的ILD患者，包括结缔组织疾病相关的ILD、慢性超敏性肺炎和其他未分类的ILD，有不同比例的患者发展为进行性纤维化的ILD。2021年，在该人群的治疗性临床试验中提出了诊断进行性纤维化间质性肺病的标准。尽管这些标准可以有效地诊断疾病进展的ILD患者，但其早期诊断效果较差。

几种基于血液的生物标志物与IPF和其他纤维性ILD患者的差异进展有关。在2020年的一项研究中，作者表明，血浆中的CXCL13（一种负责B淋巴细胞激活的趋化因子）浓度与不同组ILD的进展风险增加相关，包括结缔组织疾病相关的ILD、慢性超敏性肺炎和未分类的ILD。虽然炎症是结缔组织病相关的ILD和慢性过敏性肺炎的显著特征，但炎症信号似乎在纤维性主导的ILD中也有重要作用。因此，细胞因子、白介素和其他免疫介质可能是进行性纤维化间质性肺病的有用生物标志物，而不作为间质性肺病的早期诊断。

作者在纤维化结缔组织病相关的ILD,慢性过敏性肺炎和未分类的ILD患者中，对炎症相关蛋白进行了多中心、靶向的蛋白质组学研究，以发现和验证早期诊断进行性肺纤维化的新型生物标志物。作者假设血浆生物标志物和进行性纤维化间质性肺病的临床诊断是强有力的。然后作者推导并验证了一个蛋白质组学来预测进行性间质ILD患者并且在考虑和不考虑蛋白质组特征分类的情况下设计临床试验的样本量。

1. biomrker筛选

385名来自加州大学戴维斯分校（UC）和加州大学旧金山分校（UCSF）的患者作为发现集，来自德克萨斯大学西南医学院的204名患者作为验证集。抽血后12个月，用力肺活量（FVC）相对下降小于10%的存活患者被认为患有非进展性间质性肺病。因任何原因死亡、接受肺移植或抽血后12个月内肺叶覆盖度相对下降10%或以上的患者被认为患有进行性纤维化间质性肺病。前期在发现集中共筛选325个biomarker。其中，31个biomarker例如KRT19，ITGB6，PLAUR等与进行性间质性ILD关系最为密切。并且，在这31个biomarker中，17个例如ITGB6，KRT19，IL17C在验证集中也表明与进行性间质性ILD关系最为密切。将发现集与验证集联合分析发现，PLAUR，ITGB6，SPON1，HGF，PRSS8和KRT19与进行性间质性ILD的诊断。根据生物标志物浓度四分位数对联合队列进行分层后观察到差异无进展生存期浓度最高的生物标志物中位生存期小于12个月。在评估已验证的生物标志物与单个进展性纤维化ILD预后之间的相关性时，所有生物标志物与死亡或肺移植和用力肺活量有很强的相关性。

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图1 火山图展示了发现集中上调或者下调的biomarker

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图2 发现集与验证集联合分析中最明显的biomarker的1年无进展生存期

根据ILD临床诊断对联合队列进行分层后，发现PRSS8与进展性纤维化ILD的相关性存在异质性，FASLG也存在异质性，但没有观察到其他有效的生物标志物。当在高分辨率CT上根据形态学模式对亚组进行分层时，作者观察到ITGB6与进行性纤维化ILD相关的异质性，并观察到FASLG、PRSS8和SPON1与进行性纤维化ILD相关的异质性。在评估ILD-GAP分期亚组时，观察到AGER，ITGB6和SCGB3A2与进行性纤维化ILD之间存在显著的异质性，KRT19和SPON1之间存在相关性关联。线性回归显示，生物标志物浓度与ILD-GAP分期之间大多呈正相关，提示某些生物标志物的血浆浓度可能与疾病严重程度相关。通路富集结果显示，与进行性纤维化ILD相关的通路主要参与免疫和宿主反应（IL-17信号，细菌和病毒的模式识别受体，粒细胞粘附和脱落）和纤维形成（肝胆汁淤积，心脏肥厚信号，HMGB1通路，肝纤维化通路，以及通过生长因子调节上皮间质转换）。

2. 蛋白质组学特征分析

根据基线肺功能应用临床试验排除标准后，衍生队列中仍有270例患者，验证队列中仍有119名患者。在衍生队列中，LASSO选择了12个生物标志物进行蛋白质组学标记:AGER、CST7、CXCL10、DPP10、FASLG、ITGB6、KRT19、MEPE、PLAUR、PNPT1、TNFSF11和WFIKKN2。基于最终的模型点估计，利用log2转换的生物标志物值，通过以下公式确定蛋白质组学风险评分:蛋白质组学风险评分=0.053 + (0.884 × AGER) + (1.285 × CST7) + (0.715 × CXCL10) +(1.657 × DPP10) + (0.745 × FASLG) + (1.443 × ITGB6) + (1.451 ×KRT19) + (0.578 × MEPE) + (2.070 × PLAUR) + (0.709 × PNPT1) +(0.902 × TNFSF11) + (0.490 ×WFIKKN2)。推导队列的蛋白质组学风险评分曲线下面积为0.79，验证队列的曲线下面积为0.73。在对潜在蛋白质组学评分阈值进行探索性分析后，评分小于0·3的为低风险蛋白质组学特征，高于该阈值的为高风险蛋白质组学特征。结果是敏感性为0.85，特异性为0.58，阳性预测值为0.54，阴性预测值为0.54和0.87。当应用于验证队列时，蛋白质组学特征表现相似，敏感性为0.90，特异性为0.53，阳性预测值为0.50，阴性预测值为0.91。两组的高阴性预测值表明，约10%具有低风险蛋白质组特征的患者在抽血后一年内会发生ILD进展。

与低危蛋白组特征的患者相比，具有高危蛋白组特征的患者发生进行性纤维化间质性肺病的风险几乎高7倍(OR6.73, 95% CI 4·00 -11.33)。当对个体结果建模时，一个高风险的蛋白质组学特征与发生10%或更高的覆盖度相对下降的风险(5.77,3.31- 10.05)和死亡或移植风险(8.0,2.39-26.8)的几乎6倍相关。与低风险蛋白组特征的患者相比，具有高风险蛋白组特征的患者在一年内的FVC变化明显更大。这一观察结果在高分辨率CT模式分层后仍然存在。

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图3 纵向图比较具有高风险和低风险蛋白质组特征的患者1年的FVC变化

整个队列的FVC变化为-99·6mL (95% CI -150·2至-49·8)。低危蛋白组特征患者的FVC变化为+87.5 mL(6·9 ~ 164·4)，高危蛋白组特征患者的FVC变化为-227·1 mL(- 286·7 ~ -167·5)。在不考虑蛋白质组特征的情况下，采用1:1随机设计的理论随机对照试验需要676例患者在90%的功率下检测到FVC下降50%，假设标准偏差为200mL，双尾α为0.05。假设相同的参数，限制高风险蛋白质组特征患者的类似试验将需要142名患者。

在这项研究中，我们在慢性超敏性肺炎、结缔组织疾病相关的间质性肺病和不可分类的间质性肺病的联合队列中确定并验证了进展性纤维化ILD的17个循环血浆生物标志物，其中大多数是新发现的。对于大多数被评估的分析者来说，与进行性纤维化间质性肺病表型相关的生物标志物对间质性肺病的临床诊断和高分辨率CT形态学具有很强的相关性。根据GAP分期分层后，发现进行性纤维化间质性肺病相关的异质性，提示生物标志物浓度可能与疾病严重程度相关。然后得到了进行性纤维化间质性肺病的蛋白质组学特征，在独立验证队列中测试时显示出良好的性能。尽管许多循环蛋白生物标志物与进行性纤维化间质性肺病相关，和蛋白质组学研究已经发现了新的生物标志物，可将IPF与健康对照区分开。这项研究是第一个使用蛋白质组学技术在非IPF型间质性肺病患者中识别进行性纤维化间质性肺病的新生物标志物。

质谱分析蛋白质组学的基本原理主要是通过测定被测样品离子的理化性质来进行分析，根据样品的质量谱图和相关信息从而得到定性和定量结果。目前，蛋白质组学质谱分析一般是根据保留时间（retentiontime）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度对肽蛋白质进行鉴定和定量，即3D蛋白质组学。

4D蛋白质组学在3D蛋白质组学的基础之上增加了第四维度，离子淌度（mobility），主要根据离子的形状和截面对离子进行分离，能够区分m/z差值非常小的肽段，使低丰度蛋白信号能够被区分和识别出来。4D蛋白质组学基于timsTOFPro质谱仪，结合PASEF（ParallelAccumulation Serial Fragmentation，同步累积连续碎裂）与TIMS（TrappedIon MobilitySpectrometry，离子迁移谱），可重复测量所有检测离子的碰撞截面（CCS），能更快、更灵敏的进行蛋白质组定性和定量。