流式细胞术的应用

流式细胞术是一种可对溶液中的单个细胞进行快速筛选和分析的技术。流式细胞仪利用激光作为光源产生散射光和荧光信号，这些信号由光电二极管或光电倍增管等检测器读取。这些信号被转换成电子信号，标准化格式 (.fcs) 数据文件输出。特定的细胞亚群可以基于它们的荧光或光散射特性进行分析并进行分离纯化。

在流式细胞术中可使用多种荧光试剂。这些包括荧光偶联抗体、DNA结合染料、活力染料、离子指示剂染料和荧光蛋白。

流式细胞术是一种强大的工具，可应用于免疫学、分子生物学、细菌学、病毒学、癌症生物学和传染病监测，为免疫系统和其他细胞生物学领域的研究提供了前所未有的细节和分辨率。

流式细胞术的应用领域：

免疫表型分析是流式细胞术中最常用的应用。它利用流式细胞术的独特能力同时分析混合细胞群的多个参数。

在最简单的形式中，免疫表型实验包括用荧光染料偶联抗体染色的细胞，这些抗体针对细胞表面的抗原。

大多数这些抗原被标记为CD+数字的形式，以便定义针对特定细胞抗原的单克隆抗体。大多数免疫细胞具有特定的CD标记物，将它们定义为一个细胞亚群。

这些细胞标记称为谱系标记，用于定义特定细胞群，以便在每个免疫表型实验中进行额外分析。例如T细胞标记（CD3、CD4、CD8）、B细胞标记（CD19、CD20）、单核细胞标记（CD14、CD11b）和NK细胞标记（CD56、CD161）。

除了定义细胞群的谱系标记外，还使用其他标记来表征每个细胞群。这些标记可以包括激活标记（CD69、CD25、CD62L）、记忆标记（CD45RO、CD27）、组织归巢标记（α4/β7）和趋化因子受体标记（CCR7、CCR5、CXCR4、CCR6）。

通常，免疫表型实验还包括细胞内标记物，例如FoxP3（Treg细胞）、细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2定义Th1 细胞）、增殖标记物（Ki67、CFSE）和抗原特异性标记物（主要组织相容性或MHC四聚体）。

通过用特定抗原刺激细胞，然后通过MHC多聚体寻找细胞因子的产生、增殖、激活、记忆或抗原识别，可以测量抗原特异性反应。MHC多聚体是MHC单体（MHC-I 或 MHC-II），它们通常被生物素螯合，然后以四聚体、五聚体或十聚体形式与荧光链霉亲和素骨架结合。这些MHC多聚体“装载”了选择的抗原，然后用于与识别抗原的T细胞结合，从而表明对特定抗原的反应水平。这类通常用于疫苗研究。

在抗体药物的临床前研发中，一旦确定抗体药物的分子形式并在哺乳动物细胞中表达出抗体蛋白分子后，就需要对抗体的活性进行验证与测定。活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。目前研发生产中主要通过测定抗体的抗原结合能力来评价活性，常用的方法有ELISA法；流式细胞仪法；一些新技术测定法如SPR技术，目前应用较为广泛的是GE医疗生命科学的Biacore。另外还可以模拟抗体的作用机制，测定其体外生物学活性并进行评价。

流式细胞仪测定与ELISA法测定原理基本相同，不同的是将可溶性抗原变为细胞，并通过流式细胞仪测定细胞的阳性率指标来检测待测抗体与标记抗体的竞争结合情况。该方法的优点是选用携带抗原的细胞进行检测，细胞表面的抗原空间结构更接近体内存在形式，使待测结果更接近实际情况，另外该方法还避免了相应抗原的制备纯化过程，对于不易获得可溶性抗原的抗体可采用该方法进行测定

细胞内细胞因子分析是通过用蛋白质转运抑制剂（Brefeldin A或Monensin）处理细胞2-12h来进行的，这样细胞产生的任何细胞因子都可以在细胞内积聚，从而实现更好的检测。

在此孵育过程中，可以用各种抗原刺激细胞，例如来自疫苗的肽以测量免疫反应。在蛋白质转运抑制剂处理后，对细胞进行活力标记和细胞表面标记染色，然后固定和透化以使用抗细胞因子抗体进行细胞内染色。

通过流式细胞术检测细胞凋亡，利用与凋亡相关的偶联抗体多个目标。

质膜的易位是由膜联蛋白V染色的目标，DNA的内切酶消化由一种利用末端脱氧核苷酸转移酶标记与细胞凋亡相关的DNA断裂末端的技术——TUNEL靶向（TdT dUTP Nick End Labeling）测定，胱天蛋白酶的活化可以通过抗体和染料靶向线粒体凋亡由染料靶向，染料可确定线粒体膜电位和通过（Hoescht 33342）染色检测的细胞核中的染色质凝聚。