细胞活力和增殖能力常常被用于评估分选后细胞的功能活性。从单个细胞悬液中进行高速分选存在许多影响因素，因此分选后细胞的活力是决定分选是否成功的最关键因素之一。众所周知相对于基于石英杯的系统，空气激发的流式细胞分选仪具有更好的细胞存活率[1]。在本研究中，使用Invitrogen™ Bigfoot™全光谱流式细胞分选仪和Invitrogen™ Attune™ CytPix™成像型流式细胞仪，分别对分选后的人全血、NIH 3T3和Jurkat细胞样品进行健康评估以及监测72小时内的细胞增殖情况。在Bigfoot上分选后的T细胞的增殖、功能和活力结果与分选前的细胞活性相当，说明Bigfoot全光谱流式细胞分选仪在分选过程中可以保持细胞的高活性。本文详细描述了如何利用Bigfoot获得最佳细胞活力的技术要点，以及对分选后细胞活力和增殖功能进行优化的实验流程。
1. 确认测试液流没有溅射，并正确偏转对准分选管/板。
Tip:如果测试液流显示有溅射的情况，重新运行液流设置。如果液流还是不理想，可以尝试不同的喷嘴振动频率和振幅。
液流溅射和偏转不正确会导致分选低纯度，并且细胞可能会错过收集容器或撞到管/孔侧壁。
2.如果细胞活力在分选过程中或连续运行中发生变化，最好在样品之间进行两次冲洗。
Tip:使用Windex或清洁剂在分选前进行高压清洗。如果这不能解决问题，请替换样品管路。
3.确定哪种连黏体排除门对你的细胞最有效。
Tip:如果连黏体圈门策略FSC- A vs FSC-H效果不好，可以更换为SSC-A vs SSC-H。
在某些情况下，需要使用两个连黏体排除门。
4. 考虑改变鞘液压力(即100 μ m喷嘴可以运行30 PSI或20 PSI)或尝试更大直径的喷嘴来帮助提高活力。
Tip: 对于大于15微米的细胞，请考虑使用120µm或150µm的喷嘴。对于更小更脆弱的细胞，考虑在20 PSI下使用100µm的喷嘴。针对不同喷嘴，样品Boost压力和时间也需要适当调整。
5. 在分选之前，观察每秒的Events数目以确保流速稳定。
Tip: 使用连续时间图并监测液流稳定性。
6. 准确设定分选靶点。提供足够的着陆缓冲，使细胞在分选过程中进入缓冲液，如果进行长时间分选，则用FBS包被收集管。
Tip：包被管子的方法，在试管中填充含血清的培养基，并在分选前静置≥1小时，然后丢弃培养基，按下图进行分选。
7. 对于非常脆弱的样品，Pluronic f68将有助于提高活力[2]。
Tip: Pluronic f68可以直接添加到细胞培养基或某些鞘液中。
Pluronic充当细胞膜的保护伞，保护脆弱的细胞，如果蝇S2细胞。
细胞活力和增殖验证
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1.用核酸染料(7-AAD)染色PBMCs，再分析样品，确定活细胞群。
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用100µm喷嘴分选，细胞分选速率300个/秒，共分100000个细胞。
2.采用核酸染料排除法验证系统各组成不影响细胞活力。
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测试的部件包括:上样针，样品管线，鞘液，Boost压力和不同喷嘴。
用许多不同的实验参数测试了7种不同的细胞系。上表为部分名单。
3.NIH 3T3细胞用100µm喷嘴在30 PSI下分选到96孔板上。
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板中含有DMEM和10% FBS。
在72小时内对细胞进行培养、成像和计数。
4.Jurkat细胞用CFSE染色，在Bigfoot上用100µm喷嘴在30 PSI下分选。
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分选后的细胞用DAPI染色，在显微镜下成像。
98%的细胞活性较好。
分选后的Jurkat细胞在不同时间传代后进行分析。增殖率和活力与在相同浓度下未分选的对照细胞相同。
5.使用Attune CytPix用于进一步研究细胞的健康状况。
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Attune CytPix可以提供所有三种状态的图像:活的、凋亡的和死亡的。
细胞在Bigfoot上分选，分选后的细胞在Attune CytPix上分析。
6.细胞活力与高纯度和高回收率高度相关。
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使用NIH 3T3, Jurkat, CHO和PBMC，在100µm的喷嘴下，以30 PSI的鞘液压力分选入5 mL流式管中，均获得了高活力，回收率和纯度。
在Jurkat和PBMC的70µm喷嘴分选中，以60 PSI的鞘液压力下也得到了类似的回测结果。
参考文献
1. Pfister et. al. An evaluation of sorter induced cell stress (SICS) on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) after different sort conditions - Are your sorted cells getting SICS. Journal of Immunological Methods. 2020, 487, 112902
2. Vidigal et. al. A cell sorting protocol for selecting high-producing sub-populations of Sf9 and High Five cells. Journal of Biotechnology. 2013, 168, 436-439
3. Cell Viability, Proliferation and Function after Single Cell Sorting as Characterized by Flow Cytometry and Imaging. Matthew Meyer, Susan O''Meara and Karen Helm, Thermo Fisher Scientific, 145 East Mountain Avenue, Fort Collins, CO 80524
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