干货 | 基因功能研究之双荧光素酶报告分析

前面的推文中，我们简单介绍了基于转录组+代谢组的技术手段进行基因的挖掘和筛选后，下一步的工作是基因的功能研究。基因功能研究包括酶活，基因过表达，双荧光素酶实验，酵母单杂，染色质免疫共沉淀，EMSA等等。我们今天就来详细介绍下，什么是双荧光素酶报告实验技术，以及双荧光素酶报告实验技术在转录组+代谢组文章后期的应用。

荧光素酶是最初从自然界发光生物中获得的一种可以催化对应的荧光底物发生氧化反应产生荧光的蛋白酶类物质，哺乳细胞没有内源性荧光素酶。荧光底物与酶发生反应产生的光其本质是一种生物萤光，属于可见光，不依赖外源激发光作用，在自然界一些发光生物身上通常能见到这种生物萤光。除萤火虫类昆虫外，目前在自然界中已经发现了多种可以发光的生物，人们对这些来源于不同发光生物的荧光素酶进行了提取，并分类为萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）、细菌荧光素酶（bacterial luciferase）和另外一从发光甲虫、发光海洋生物提取的荧光素酶。萤火虫荧光素酶最早提取于一种北美萤火虫（Photinus pyralis），目前已在世界各地的萤火虫中提取到萤火虫荧光素酶。在1960年，美国乔治亚大学（University  of Georgia）的Cormier等研究者从海肾（renilla）中提取了海肾荧光素酶（Renilla reniformis luciferase），为海肾荧光素酶在科研中的应用打下了基础。早在1988年就有通过对荧光素酶报告基因表达的蛋白的荧光强度进行检测，进而综合分析不同处理条件对基因启动子活性影响。在 1990年，经过两年的研究与发展形成了一套相对成熟的荧光素酶生物传感器技术，同年其发明者加入了Promega公司。经过几年的潜心研发，1996 年 Promega 公司正式发布了双荧光素酶报告基因系统并开始销售相关检测试剂，这种技术创造性地结合了萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶两种荧光检测体系，是荧光素酶技术在漫长发展历史中的一次重要的突破。

双荧光素酶是在单荧光素酶的基础上发展起来的，双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）包括萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶两部分。海肾荧光素酶作为转染的内参，可以归一化实验数据。

将目的基因的启动子插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，就可以用来检测转录因子对启动子的作用，启动转录越多，那报告基因的表达量就越大，荧光值越高。

将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素活性。

双荧光素酶报告基因检测包括四个步骤，分别是质粒构建、细胞转染、报告基因检测和数据分析。

转录因子是一种可以与真核基因顺式元件发生特异性相互作用，从而抑制或者激活基因表达的蛋白。去验证转录因子对目的基因是否可以结合及调控作用，需要对转录因子和目的基因的启动子分别构建质粒。

双萤光素酶报告基因系统一般将萤火虫萤光素酶报告基因质粒和海肾萤光素酶报告基因质粒共转染细胞，或将这两个报告基因构建到同一个骨架质粒上（如pGL4质粒），分别用不同的启动子启动其表达。

以pGL4质粒为例，需要构建两个质粒，报告基因质粒：将转录因子的调控元件克隆在Luciferase的上游，用来启动荧光素酶的表达及内参基因表达；报告基因质粒：将转录因子的调控元件克隆在Luciferase的上游，用来启动荧光素酶的表达。

培养293细胞（或其它目的细胞），将构建好的报告基因质粒和转录因子表达质粒进行扩增提纯，培养293细胞（或其它目的细胞）。

适当的方法提取蛋白，加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。

计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。

2020年6月，四川大学生命科学学院张阳/刘明春课题组在Molecular Plant发表了名为“MicroTom Metabolic Network: Rewiring Tomato Metabolic Regulatory Network throughout the Growth Cycle”的论文。本研究通过整合20个不同发育阶段及不同组织样本的时空高分辨转录组和代谢组数据，构建了MicroTom代谢网络数据集（MMN），基于MMN，发现编码bHLH转录因子的基因(Solyc01g096370)与生物碱合成代谢通路基因和代谢物共表达极显著，并且Solyc01g096370与已知的调节因子SlGAME9有大量的共同调控代谢产物和基因，提示Solyc01g096370可能调节生物碱代谢通路。为了研究Solyc01g096370是否直接诱导SGA生物合成基因的表达，利用拟南芥原生质体进行了双荧光素酶报告基因检测，证明了Solyc01g096370是SGA生物合成途径的阳性调节因子。

2021年3月2日，四川农业大学小麦研究中心王际睿教授团队在国际著名期刊New Phytologist上发表了题为Myb10-D confers PHS-3D resistance to pre-harvest sprouting by regulating NCED in ABA biosynthesis pathway of wheat的研究论文。证实Myb10-D 通过激活NCED转录调控萌发，增强小麦收获前发芽（PHS）的抗性。作者使用双荧光素酶报告基因(DLR)系统鉴定Myb10-D如何影响ABA3和NCED的表达。证实Myb10-D直接与NCED启动子192-199 bp的SMRE结合并在功能上激活其表达。

2022年3月1日，中科院植物所宋献军研究组在PNAS发表了题为A multiomic study uncovers a bZIP23-PER1A-mediated detoxification pathway to enhance seed vigor in rice的研究论文，揭示了活性氧清除途径改善种子活力的新机制。作者对两个种子活力不同的亚种水稻品种的转录组（RNA seq）和广泛靶向代谢谱的比较分析表明，不同的生物途径和代谢过程是解释性状差异的关键影响因素。并通过构建共表达调控网络，筛选到包括bZIP23和bZIP42在内的转录因子可能作为重要的调控节点，揭示了活性氧清除途径改善水稻种子活力的新机制，为进一步改良作物相关农艺性状提供有用的靶标。为了检查 bZIP42 和 bZIP23 是否具有转录调节活性，进行双荧光素酶报告基因 (DLR) 测定，结果表明 bZIP42 和 bZIP23 可以直接与启动子结合并显著激活PER1A的表达。

2021年9月，中国农业科学院蔬菜花卉研究所园艺作物生物学与遗传改良重点实验室李君明研究员和程锋研究员共同为通讯作者在Journal of Experimental Botany在线发表了题为“All-Flesh Tomato Regulated by Reduced Expression Dosage of AFF Through a Promoter SV Mutation ”的研究论文。本研究以在果实发育和成熟过程中一直保持固态结构，不形成凝胶状的心室胶状物的全果肉番茄为材料，成功揭示了启动子区的结构变异影响花发育模型D-类基因AFF的剂量效应导致番茄不形成凝胶状的心室组织，并证实了番茄心室组织是由胎座组织向外衍生而来的推断。为了研究AFF的遗传特性，首先通过遗传分析证实了AFF性状是由单个隐性突变控制的，精细定位发现一个416bp的缺失位于Solyc06g064840基因上游1775bp，这个缺失相关基因Solyc06g064840是AGAMOUS家族的成员，属于MADS-box D-class基因，也被命名为SLMBP3，该基因在番茄发育的心室组织(包括种子)中特异表达。为证实416bp缺失对相关基因表达的促进作用，通过实时荧光定量PCR和双荧光素酶报告系统检测AFF的表达。通过荧光素酶相对活性实验验证WT和AFF样品中启动子序列的转录活性，AFF启动子中荧光素酶的相对活性显著低于WT启动子。这些结果说明AFF基因启动子区的416-bp序列对AFF的转录调控和功能具有重要作用。