网络药理学 | IF 10！代谢组和网络药理学揭示苇茎汤治疗非小细胞肺癌机制

迈维代谢

2023.3.21

作者迈维代谢

TA的动态

代谢组学和网络药理学分析揭示Tricin 通过抑制PRKCA 和鞘脂信号传导抗肝癌

● 期刊：Pharmacological Research

● IF：10.334

● 发表单位：澳门科技大学

研究背景

美国癌症协会报告说，肺癌和支气管癌是所有类型的恶性肿瘤中死亡率最高，占所有病例的22%。同时，肺癌的5年总生存率为21%。全球癌症观察站（GLOBOCAN）显示，全球大部分癌症病例发生在中国，这是由于人口规模等人口因素造成的。目前，非小细胞肺癌（NSCLC）成为最流行的类型，其通常的治疗方法包括因为手术、化疗、放疗和靶向治疗都有各种不足之处需要改进。使用免疫检查点抑制剂的肿瘤免疫疗法是全球最突出的治疗类型。尽管取得了一些成功，但只有不到30%的患者从这种疗法中受益。最糟糕的是，在使用免疫疗法时，经常会遇到与免疫相关的不良反应，包括胃肠道毒性、肝炎和内分泌疾病，从而导致严重的健康问题。因此，寻找一种副作用最小的替代有效疗法是紧迫和必要的。

苇茎汤（WJD），来自于医学圣人张仲景（公元150-215年）所著的经典中医著作《金匮要略》。临床上，苇茎汤已成功用于治疗肺系统疾病。在基础研究方面，熊教授将苇茎汤与麦门冬汤、顺铂联合用药抑制A549癌细胞生长，揭示其机制为PI3K/AKT信号通路失活。该汤还成功地应用于慢性阻塞性肺疾病的联合药物治疗。苇茎汤由芦根、薏苡仁、桃仁和冬瓜子组成，临床上按60:30:24:60的比例配伍。据报道，该配方中的一些草药在征服癌症方面发挥了有效作用。然而，苇茎汤是否可以用于治疗非小细胞肺癌尚未得到好证实，值得注意的是，苇茎汤的关键活性成分和靶点仍然未知。

网络药理分析的一个显著优势是可以直接根据网络清楚显示的结果进行一些验证实验。值得注意的是，应该全面仔细地搜索数据库，以提取数据，避免数据丢失。另一方面，代谢重编程广泛存在于肿瘤细胞中，以满足肿瘤细胞增殖和能量供应的需要。代谢靶向抗肿瘤治疗正在引起研究人员的注意。代谢组学是最新的组学技术，可用于识别正常生理和病理条件下生物体的整体代谢谱变化。同时，该方法也被用于监测疾病进展和识别中药治疗组和对照组之间的差异代谢物，表明中药方可以恢复葡萄糖、氨基酸和脂质等多种代谢途径。例如，通过基于UPLC/Q-TOF MS 的代谢组学分析，气郁散龙汤(QYSLD) 专门用于调节甘油磷脂。

研究思路

研究结果

1. 数据收集+网络分析

为了探索苇茎汤（图1A）对抗NSCLC的多成分、多靶点和多种途径，进行了网络药理学分析。

首先，对TCMSP数据库进行了广泛搜索，共鉴定了苇茎汤中的46种化合物。接下来，通过TCMSP和BATMAN-TCM数据库确定苇茎汤的2种主要药材、2种主要成分和39个靶标。

同时，从CTD数据库中提取的8127 个基因和从DisGeNET 数据库中提取的2242 个基因是NSCLC的靶标，其中21个靶标与苇茎汤的分子靶标重叠（图1B）。其中前10个靶标，它们是PTGER3、ADRA2B、AR、CNR2、PRKCB、ALOX5、PPP2CB、CNR1、PRKCA和PGR作为潜在hub蛋白。同时，通过clusterprofiler进行与hub蛋白相关的通路富集分析（图1C），通路主要涉及癌症中的神经活性配体-受体相互作用、鞘脂信号通路和胆碱代谢。

最后，构建2种主要草药、2种主要生物活性成分和21个预测靶标映射到27个相应的途径上网络图（图1D）。综上所述，生物信息学数据表明，对NSCLC的抑制可能涉及芦根和薏苡仁。它们的主要化合物分别是麦黄酮和薏苡仁内酯。芦根中的Tricin 对PRKCA 和PRKCB 具有调节作用，从而进一步影响NSCLC 通路。

■ ■ ■ ■ ■

图1 中药-成分-靶点-通路网络图分析

2. WJD体内验证实验

①异种移植小鼠模型药效评价实验

WJD组6天后肿瘤生长明显受到抑制（图2A）。经该配方治疗的小鼠体重未受到显著影响，表明WJD治疗后没有明显的毒性（图2B）。15天后，测量肿瘤的重量（图2C，D）。具体而言，WJD组的肿瘤抑制率为41.40％（P <0.05）。

免疫组织化学分析显示，苇茎汤显著降低细胞增殖（图2E）。同样，苏木精和伊红染色显示WJD改变了肿瘤细胞的形态结构。定量PCR用于评估WJD对上述网络中提到的前十个基因表达水平的影响。结果表明，WJD处理后Alox5和Prkca的表达水平显著下调，尤其是Prkca基因，而Cnr1的表达水平显著上调。其他七个基因的表达水平发生了变化，但没有统计学差异（图2G）。

在生存分析中，WJD组的生存时间明显长于对照组（P < 0.05）。在这个实验结束时，仍然有一只用苇茎汤处理过的老鼠活着，但对照组中没有一只老鼠存活（图2F）。因此，这些数据共同证明了WJD 能够抑制肿瘤生长并延长生存期。

■ ■ ■ ■ ■

图2 异种移植小鼠模型药效评价实验

②代谢组学验证

为了解苇茎汤对NSCLC代谢的影响，对小鼠血浆样品中的代谢物进行了检测和分析。PCA得分图展示了检测的稳定性和可重复性。此外，PLS-DA和OPLS-DA均更好地应用于显示苇茎汤组与对照组显著分离（图3B）。通过OPLS-DA 中的变量重要性VIP> 1和P< 0.05筛选到30个差异代谢物，苇茎汤组8个代谢物上调（倍数变化> 1）和22个代谢物下调（倍数变化<1），表明WJD部分将NSCLC中的无序代谢物纠正到正常水平。在聚类热图中展示了血浆中的差异代谢物（图3D）。根据P值，6种代谢物包括牛磺脱氧胆酸、3alpha,4,7,7alpha-Tetrahydro-1H-isoindole-1,3(2H)-dione、P-Tolyl Sulfate、1-磷酸鞘氨醇、N-(3 -乙酰氨基丙基)吡咯烷-2-酮和N-乙酰-L-谷氨酸5-半醛明显(P < 0.01)。

KEGG富集分析进一步证明了鞘脂信号通路、鞘脂代谢等8个通路是主要被干扰的通路（图3C）。有趣的是，差异代谢物1-磷酸鞘氨醇(S1P)是鞘脂信号通路中的一种生物活性脂质介质，同时前面构建的网络也表明，鞘脂信号通路属于苇茎汤治疗NSCLC的主要相应通路。因此，结合生物信息学和代谢组学分析来解释苇茎汤的抗NSCLC机制。

■ ■ ■ ■ ■

图3 血浆代谢组学检测及结果分析

3.Tricin治疗机制体/内外验证实验

①Tricin细胞毒性实验+平板克隆形成实验

为了确定Tricin（图4A）是否对各种小鼠或人类NSCLC细胞具有任何特异性细胞毒性作用，通过MTT法检测了具有普遍驱动突变（如KRAS、EGFR、ROS和ALK）的8个NSCLC细胞系：Lewis肺癌细胞（LLC细胞）、H2122、H358、H1299、A549、H1975、HCC78和HCC827细胞。用150、75、37.5、18.75、9.375和0 μmol/L的Tricin处理细胞。

Tricin对LLC细胞和具有KRASG12C突变的人NSCLC细胞系（包括H2122和H358）以剂量依赖性方式显示出选择性细胞毒性作用（图4B-D）。然而，另外5种NSCLC细胞系的活力并没有被Tricin显著抑制。当用增加浓度的Tricin处理时，存活LLC细胞的数量显著减少，表明Tricin可以抑制增殖（图4G）。此外，Tricin还以剂量依赖性方式强烈抑制LLC细胞的平板克隆形成能力（图4H）。

同时，为了了解Tricin的细胞毒性是否具有癌症特异性，还测试了其对正常人肺成纤维细胞CCD-19Lu的细胞毒性（图4E）。汇总LLC细胞、H2122、H358和CCD-19Lu 细胞中Tricin 的IC50值（图4F）。结果Tricin在CCD-19Lu细胞中的IC50值高于300 μM，表明Tricin对正常人肺细胞是安全的。这些结果共同证明了Tricin的细胞毒作用是肿瘤细胞特异性的，这可能有利于临床药物应用。

■ ■ ■ ■ ■

图4 Tricin细胞毒性实验+平板克隆形成实验

②Tricin影响LLC细胞迁移和凋亡能力

为了研究Tricin是否会影响LLC细胞迁移和凋亡能力。在0小时划伤的间隙明显（图5A）。但无论是12小时还是24小时后，Tricin明显呈剂量依赖性减缓细胞迁移。实验重复3次，计算间隙宽度，表明Tricin确实抑制LLC的迁移（图5B）。

对于细胞凋亡测定，流式细胞结果显示Tricin显著增加了凋亡LLC细胞的百分比。在对照组中，只有0.86%的凋亡LLC细胞。然而，当用150 μmol/L的Tricin处理时，百分比增加到16.48%（图5C）。三个独立重复实验结果的平均值清楚地显示在条形图中（图5D）。

此外，为了从蛋白水平上证实Tricin促凋亡的作用，通过蛋白质印迹测定磷酸化AKT（p-AKT），总AKT (TAKT)、Bcl-XL、全长PARP和切割的PARP的水平。结果表明，在LLC细胞中，切割的PARP水平增加，而全长PARP、Bcl-XL和p-AKT的水平被Tricin以剂量依赖性方式降低。Tricin对总AKT的影响很小（图5E）。这些结果共同表明，Tricin可以通过增强肿瘤细胞凋亡来部分抑制LLC细胞的生长。

■ ■ ■ ■ ■

图5 Tricin影响LLC细胞迁移和凋亡能力实验

③qPCR+蛋白质印迹+转基因实验

网络药理学推测Tricin对PRKCA有调节作用。代谢组学分析确定了一种差异代谢物S1P，它受鞘氨醇激酶1 (SPHK1) 和鞘氨醇激酶2 (SPHK2)调节，参与细胞增殖。因此，进一步利用分子研究来验证Tricin对LLC细胞增殖抑制的治疗机制。

定量PCR结果显示Prkca、Sphk1和Sphk2基因的表达水平在用不同浓度的Tricin处理后均显著降低（图6A-C）。同时，蛋白质印迹检测显示蛋白水平结果与基因水平结果一致。Tricin显著降低了磷酸化PRKCA、SPHK1和SPHK2的蛋白质水平。Tricin对总PRKCA的影响很小（图6D）。

此外，为进一步验证Tricin是否对PRKCA有重要影响，通过流式细胞仪评估了敲除Prkca基因时Tricin对LLC细胞的凋亡影响。蛋白质印迹结果证明成功构建稳定敲除Prkca基因的sh-Prkca LLC细胞系（图6E）。然后，流式细胞仪结果显示，在用Tricin处理Prkca敲低的LLC 细胞中，凋亡细胞明显减少，证明PRKCA是Tricin诱导的细胞凋亡重要中介（图6F和G）。

■ ■ ■ ■ ■

图6 分子实验验证Tricin治疗机制

④体内实验

最后，探讨了Tricin抑制体内肿瘤生长的作用。Tricin（25 mg/kg）、Tricin（50 mg/kg）、阳性对照顺铂和苇茎汤均显著抑制肿瘤生长，尤其是高剂量的Tricin（图7A、C）。小鼠的体重没有受到Tricin或苇茎汤的严重影响（图7B），但用顺铂治疗的小鼠的体重在治疗结束时明显下降，表明顺铂具有药物毒性。顺铂、苇茎汤、Tricin（25 mg/kg）和Tricin（50 mg/kg）的抑瘤率分别为54.49%（P < 0.001）、23.63%（P < 0.05）、43.55% (P < 0.01) 和65.03% (P < 0.001) (图7D)。

免疫组织化学分析以及苏木精和伊红染色表明，这些治疗可以显著降低细胞增殖并不同程度地改变肿瘤细胞的形态结构（图7E和F）。简而言之，这些结果都表明高剂量的Tricin (50 mg/kg)是一种有效的替代治疗方法。

■ ■ ■ ■ ■

图7 Tricin处理小鼠体内实验

本文亮点

✦本文在研究中利用网络药理学首先分析了中药复方-成分-靶点-通路，最终聚焦到影响的通路；

✦与其他的网络药理学研究不同的在于，本文的研究重点主要放在体内外验证实验中，首先借助血浆代谢组学直观的分析WJD影响的通路有哪些，这些通路佐证了网络药理学的分析结果，最终将WDJ复方中锚定到一个专一的物质麦黄酮（Tricin），接下来利用体内外实验验证该物质可以用于治疗肺癌的机制。

网络药理学-血清/组织代谢组-动物实验研究解决方案

检测技术

植物广泛靶向代谢组

1891年科赛尔首次明确的即将植物的代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢为维持细胞生命活动所必需，其代谢物存在于所有植物中，包括糖、脂质、氨基酸等;而次生代谢在种属、器官、组织和生长发育期的特异性种均存在差异，其产生的次生代谢产物也是一类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，同时很多次生代谢产物都参与植物的抗逆、抗病等过程，或者具有生理活性等作用。

植物广泛靶向代谢组学针对性检测这些物质类型，结合非靶向代谢组定性准和靶向代谢组定量准的优势建立的新型代谢组检测技术，建立超过30000种植物物质数据库，单次可以高通量定性定量检测超过1800种初生和28000种次生代谢物，全面覆盖黄酮、生物碱、萜类、香豆素、木脂素等次生代谢物，为解析植物代谢通路以及生物学问题提供重要基础。

植物广泛靶向代谢组数据库 V4.4