在中国市场上，小分子药物一直是医药市场的主力军之一。由于它们的生产成本相对较低，且容易制剂化和口服，使得小分子药物的生产和销售相对容易，因此，小分子化合物在中国市场具有广阔的发展前景。
但是，要如何快速筛选得到与靶点相互作用的具有治疗潜力的小分子呢？
近日，德国阿姆胡布兰德大学发表一篇文章[1]，选择AAA+ ATPase p97作为目标蛋白，描述了一种基于生物层干涉技术（BLI）的片段筛选策略，为筛选小分子药物提供了新的思路和方法。
这篇文章使用Octet® 非标记分子互作系统的具体实验步骤如下：通常我们检测蛋白和小分子的亲和力，固化物为蛋白，分析物为小分子，针对这种快解离的实验，固化蛋白的传感器就可以反复利用，这是高通量检测的基础。
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固化
SSA传感器PBS中平衡，Loading在含有50µg/mL (p97-ND1)或100µg/mL (p97-N)蛋白的蛋白溶液，用Biotin封闭，并在PBS缓冲液中洗涤。SSA封闭：10µg/mL生物素溶液封闭5min，p97-ND1和p97-N固化高度分别为7nm和10nm。
2
筛选
在96孔板中，将10µL、10mM DMSO文库化合物原液加入190µL PBS缓冲液(含0.05% TWEEN-20、1 mM DTT和5 mM MgCl2[仅用于p97-ND1])，制备筛选板。最终DMSO浓度为5% (v/v)。在500µM的浓度下，通过正向和反向筛选每个板，对所有碎片进行两次测量。试验设置如下:基线测量15s;结合时间60s，解离时间300s。
下面，就让我们看一看文章是如何筛选小分子的（图1）：
图1.p97的结构和片段筛选的工作流程:
a, p97的六聚体结构，大部分已知辅因子结合在由两个亚结构域Nn（蓝色）和Nc（浅蓝色）组成的N末端域。
b, 筛选流程: 首先使用p97-ND1进行实验条件的确认，然后将实验条件转移到分离的N-末端域，接着进行筛选：单浓度，多浓度，NMR筛选，最后通过正交的STD-NMR测定，并确定所选药物的结合位点。
小分子药物筛选通常包括以下步骤：
1
选择目标蛋白
选择一种具有治疗潜力的靶标蛋白，如酶、受体、离子通道等。文章选择AAA+ ATPase p97作为目标蛋白，一种在蛋白质稳态中起关键作用的必需蛋白，可作为癌症靶点；
2
方法确认
p97和ADP为小分子亲和力筛选的阳性对照（图2）；BLI的测定的动力学参数与报道的一致。而且BLI的结果的拟合非常好，小分子信号较大，数据可信，同时证明蛋白的活性。说明这个方法和体系可以用来筛选这个靶点的化合物。
图2.用p97-ND1和ADP结合确认
3
构建化合物库
对于片段筛选，使用了卑尔根大学生物物理学、结构生物学和筛选设施编制的库，该片段库是OTAVA chemicals溶解度库的679个化合物[2]。
4
筛选化合物库
1）在证明BLI技术在小分子亲和力测定方面的准确性和一致性后，然后在库中进行初步筛选（图3）。
图3.p97-ND1和p97-N 的BLI初筛：
a图为P97-ND1的筛选结果，多轮筛选中ADP信号未衰减；c图和d图中红色为hits(信号较大的候选药物)
2）选择42个具有与p97-N结合小分子片段，以剂量依赖的方式使用1000µM到31.3µM的2倍稀释步骤进行测试，36种化合物表现出剂量依赖的反应信号（图4）。
图4.四种化合物与 p97-N 相互作用的代表性结合图:
a,b图的静态拟合呈直线，亲和力较弱; c,d图静态拟合呈曲线，相对较好的hits
3）通过STD-NMR确认所选片段：对19个KD值<700uM的片段进行研究，该方法适用于消除靶蛋白固定引起的假阳性，19个中有16个显示出显著影响。
之后，使用ScoreBLI(如上图所示，包含拟合度等指标)作为标准，筛选Score BLI>0.7的片段化合物，得到13个分子（图5），同时选取动力学拟合和稳态拟合数据相差较小的十个片段作为最终候选化合物。
详细解释一下上述公式，r2是按照1:1和2:1拟合模型计算的拟合系数，r2kobs是根据Kobs与分析物浓度、Ka、Koff之间的关系线性回归计算所得，
而最后一项为“惩罚项”，达到稳定稳态平衡的信号趋于平行，此时斜率mplateau为0，非特异性结合信号产生会导致斜率大于0。
对于符合1:1结合的化合物，计算出的ScoreBLI应接近或高于1.0，而显示非特异性结合的配体应产生<1.0的值。使用ADP的结合数据评估该分数，其ScoreBLI为1.02，以及明显非特异性结合片段（TROLL9），其ScoreBLI为-0.15。
图5.计算的 ScoreBLI和测量的片段的 STD 效应筛选图
4）通过mixed-solvent MD simulation识别p97-N域结合位点（图6）：证明小分子靶向的是SHP基序结合位点的区域。在分子动力学模拟的指导下，使用基于蛋白质和配体的NMR技术以及X射线晶体学假设并实验验证了所选筛选hit的结合位点，最终产生了具有p97N结构域的小分子复合物的第一个结构。
图6 mixed-solvent MD simulations结果
本文使用BLI的方法，筛选并证明针对靶点SHP II位点的抑制剂设计的可能性，后续的设计步骤优化化合物、验证作用机制以及进行临床试验并未进行，但为进一步的药物设计提供了新的起点。
文末作者强调：
BLI是一种适合于片段筛选的生物物理方法[3]。与其他生物传感器平台相比，BLI作为一种无需流体系统的方法，具有更易于设置和处理的优势。目前的研究表明，BLI是一种适合于检测低分子量化合物结合的方法，为基于片段的药物设计提供了有前途的候选方法。因此，BLI是一个强大而性能良好的片段筛选平台。
ChatGPT是如何评价我们Octet®
的生物层干涉技术（BLI）的呢？
为什么越来越多的文章都使用了
Octet® 非标记分子互作系统呢？
非标记Direct Binding是趋势，它的结果更准确
快速测定亲和力，更加定量化对互作进行表征
无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）
测试时间短，一般10分钟，更快拿到结果；本文5分钟就可以完成实验
实验形式多样化：定性，两者结合，协同/竞争实验，垂钓
写入美国药典，文章>10000篇，认可度广
万金油技术，可以用于检测DNA、小分子、蛋白等各种生物分子
使用方便，成本相对低
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-参考文献-
1. Fragment screening using biolayer interferometry reveals ligands targeting the SHP-motif binding site of the AAA+ ATPase p97. Commun Chem. 2022 Dec 7;5(1):169.
2. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem 3, 435–444 (2008).
3. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669–676 (2011).
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