ACD/Labs
色谱柱筛选策略和案例
武汉嘉诺康
李晓雨
一
色谱柱固定相的作用力
疏水减法模型常用于固定相的选择，其主要特征作用力分别是疏水性(H)、空间位阻效应(S*)、氢键酸度(A)、氢键碱度(B)和电离硅醇基与溶质分子在中性或低pH值(C)下离子相互作用。
二
USP色谱柱参数统计与分析
- USP色谱柱库中，共计757根色谱柱；
- 占比最多的前5类色谱柱分别是：L1（C18）、L7（C8） 、 L11（苯基柱）、L10（氰基柱）、L43（五氟苯基柱）；
- 前5类色谱柱的占比，占据了总量的82.7%，需要重点关注。
01
疏水作用
疏水保留作用主要与固定相类型有关：
C18＞C8＞C4≈苯基柱≈五氟苯基柱＞氰基柱
02
形状选择
S（形状选择作用）：主要与固定相类型有关：
苯基柱、五氟苯基柱的空间选择性最佳，C18、C8基本上无空间选择性
03
氢键作用
氢键酸度（A）：数值越大，氢键作用越强，对碱性化合物保留增加
氢键碱度（B）：数值越大，氢键作用越强，对酸性化合物保留增加
04
离子交换作用
离子交换作用：数值越大，离子交换作用越强
1. pH2.8条件下，typeA离子交换作用＞typeB，因为A类硅胶金属杂质含量高，导致硅醇基酸度增加，即使是低pH条件，也会发生硅醇基解离，而B类硅胶在酸性条件下基本不发生解离，故离子交换作用低。
2. pH7.0条件下，离子交换作用>pH2.8条件，因为随着流动相pH增加，硅醇基解离程度增加。
05
延展分析
- 各色谱柱参数离散程度较大，主要原因：与固定相键合密度（碳载量）、是否封端、键合官能团种类、键合官能团方式等有密切关系。
- 以疏水保留作用为例，部分色谱柱H值极低或者极高， 分析原因：H值与碳载量呈现正相关，导致H值差异较大，举例参考如下：
展望：如果能将tanak参数与固定相物理属性参数（孔径、碳载量、封端与否、键合官能团、键合方式等）做PCA聚类分析，将会使色谱柱筛选更加清晰明了，且可能对色谱柱生产技术有一定的指导意义。
困难：1、固定相物理属性参数存在部分的技术保密；2、获取参数的工作量较大。
现将USP固定相参数H、S、A、B、C（2.8）、C（7.0）做PCA分析如下：
- 第一，第二，第三主成分的累计贡献率已高达81.214%，故可将6种固定相参数，降维至3种主要作用。
PCA因子载荷分析：
- 第一主成分的贡献率为34.339%，特点表现为因子变量在C（2.8）、C（7.0）上有较高的正载荷，可以归结为离子作用力。
-第二主成分的贡献率为31.627%，特点表现为因子变量在H上有较高的正载荷，可以归结为疏水作用力。
- 第三主成分的贡献率为15.249%，特点表现为因子变量在B、A上有较高的正载荷，可以归结为氢键作用
总结：大部分色谱柱能够提供的固定相作用力主要归结为离子作用力、疏水作用、氢键作用。
PCA得分图：以USP分类标识为区组
- 不同USP分类标识的色谱柱，在三种作用力维度下分布较为集中，说明：每种标识的色谱柱均可涉及到多种固定相作用力的提供。
- 在疏水作用维度下， L1（C18）、L62（C30）色谱柱有较为密集的分布。
- 在离子作用、氢键作用维度下，无显著区分，说明USP分类标识不是这两种作用力的关键区分参数。
PCA得分图：以typeA、typeB分类为区组
- 不同硅胶类型typeA、typeB在离子作用力维度下，区分明显，typeA的离子作用力＞typeB，分析原因：离子作用力与硅胶的纯度有关；
- 不同硅胶类型typeA、typeB在疏水作用、氢键作用维度下，无显著区分，说明硅胶类型“A、B“不是这两种作用力的关键区分参数。
- 不同硅胶类型typeA、typeB色谱柱，氢键作用与离子作用力强度呈现正相关分布。
三
色谱柱筛选实际案例
案例背景：盐酸胺碘酮原料药，USP药典方法重现
流动相：
色谱条件：
供试品：
USP推荐色谱柱：
风险评估：化合物结构+流动相+色谱柱
- 流动相pH为4.9，各已知杂质的logD在疏水保留相对稳定区，流动相pH一定程度上认为合理；各杂质的logD均大于3，有较好的保留；
- 流动相pH4.9条件下，多个杂质的N呈正离子形态；
- 由色谱柱参数C（7.0）值推测，该色谱柱的硅醇基在弱酸性条件下易发生解离；
风险评估结果：
- 解离硅醇基与电离的碱性化合物发生离子相互作用，导致碱性化合物拖尾现象，但无保留力问题；
- 在pH4.9流动相体系下，API呈离子态，且供试品浓度较高，易发生右三角形峰的质量过载，但供试品主峰面积不参与计算，无影响；该pH虽合理，但并非最佳，配制流动相时注意控制pH；
方法重现结果：
- 峰严重拖尾；主峰保留过强，杂质E和杂质I分离存在风险；
- 未电离化合物D、E、F峰也出现拖尾，该拖尾与硅醇基离子相互作用无关，推测与ODS-2色谱柱柱效下降有关（本司使用的ODS-2曾多次被用作离子对体系及中控试验），经评估，不需要购买新ODS-2重新重现药典方法，因为新的ODS-2仍会存在碱性化合物拖尾；
方法优化目标：
- 流动相体系不变的情况下，通过色谱柱筛选，保证分离选择性和保留力的前提下，改善峰形。
色谱柱筛选空间评估：
色谱柱筛选综合结果：
- 满足筛选要求的12根色谱柱中，本司仅有Xbridge C18和ACE C18两款，且Xbridge C18仅一根，由于ACE C18有3根同款，拟采用ACE C18进行方法优化。（注明：本司无ACE 5，故用的ACE 3 替代）
优化结果：
- API在pH4.9流动相体系下，API呈离子态，发生右三角形峰的质量过载，但供试品主峰面积不参与计算，无影响
- 通过对色谱柱参数进行筛选，有目的地选择色谱柱，峰形得到显著改善，且各杂质均达到基线分离，色谱柱筛选成功。
延伸：碱性化合物拖尾还可以通过改变流动相或者使用特殊色谱柱解决，本案例没有进行尝试，原因：在不改变药典分析方法的前提下可解决问题，则优选药典分析方法。
四
色谱柱筛选策略总结
01
本文提供的色谱柱筛选步骤-适用场景
- 药典分析方法重现前风险评估；
- 分析方法开发前色谱柱种类初步筛选；
- 已有分析方法，但需要优化个别化合物分离或者峰形，且通过B%梯度、温度无法达到优化目的，或者不希望调整分析方法流动相、洗脱程序等色谱条件时。
03
筛选策略小结
- 化合物结构+流动相体系评估：借助ACD软件，获得logD、pKa参数。
- 色谱柱参数综合评估：疏水减法模型参数比对。
ACD/Labs李丹的Comments
从施耐德疏水减法方程出发，结合USP色谱柱参数统计与分析，阐述了H,S,A,B,C与色谱柱固定相的相关性，并总结出USP色谱库中占比最多的5类色谱柱，分类为C18、C8 、苯基柱、氰基柱、五氟苯基柱。再通过主成分分析法得出结论，离子作用力、疏水作用和氢键作用为物质在色谱柱固定相上的保留提供了主要的作用力。最后成功利用理论分析预知方法风险并有针对性地选择替换色谱柱。
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