在神经元细胞分化过程中，🔗常用的管家蛋白（如β-actin、β-tubulin、GAPDH）表达量通常会发生变化；🔗在小鼠的不同脑组织部位，这些管家蛋白的表达也常常不一致。所以，在使用这些样品作为Western实验材料时，需要特别小心，以免因其表达量的不稳定导致误导性的Western blot定量结果。
发表在《Nature》期刊中的“Rescue of oxytocin response and social behaviour in a mouse model of autism”一文，为准确使用Western定量磷酸化eIF4E及磷酸化MNK1在脑组织中的表达，采用了Stain-Free总蛋白作为内参，而避免使用管家蛋白GAPDH。在论文中，作者使用小鼠脑组织及皮层神经元匀浆作为Western样品。
Western blot实验用来确定敲除NIgn3基因后小鼠脑组织中，磷酸化eIF4E及磷酸化MNK1水平的变化。研究者发现GAPDH的表达差异很大（红框），不适合作为内参使用；而Stain-Free总蛋白（绿框）显示出了极佳的表达一致性，从而被研究者选择为内参定量标准。
从Western的定量结果来看，敲除NIgn3基因后，MNK1磷酸化水平没有发生明显变化。而且总MNK1的表达与野生型相比也没有明显变化。
从实验Western结果来看，在此实验条件下，小鼠脑组织及皮层神经元中GAPDH的变化非常大。GAPDH的表达量变化不仅发生在野生型和基因敲除小鼠之间，甚至在同样的基因敲除小鼠之间，GAPDH的表达量也是有非常大的差异的。如果没有Stain-Free作为参考，贸然以GAPDH作为loading control，实验者必然会根据GAPDH条带的差异重新调整上样量，必然得出不正确的Western定量结果。
很显然，在这个western实验中，Stain-Free体现出非常明显的表达恒定优势，提供了准确的western定量结果。而以GAPDH为内参则容易导致错误的定量结论。
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参考文献：Rescue of oxytocin response and social behaviour in a mouse model of autism. Nature, 2020
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