注意好2点，你的荧光WB能拍到更多条带

赛默飞生命科学

2023.7.25

作者赛默飞生命科学

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化学发光Western PK 荧光Western

由于化学WB一次只能显现一种蛋白的条带，科学工作者一直在寻找在一张膜上同时显现更多条带的方法，方便同时获取更多平行数据，提高数据的收集效率，让实验更准确和更高产，比如可以同时观察到目标蛋白和上样内参蛋白，区分具有相似分子量的蛋白质（磷酸化和去磷酸化蛋白），并评价复杂的生物学通路（多个蛋白同时成像）。

技术总是在不断进步，荧光染料的不断迭代更新，成像设备的出现替代暗室，让多个条带同时成像变得触手可及。

进行荧光WB的关键点

影响荧光WB结果的因素是有一些的，从抽提蛋白到转印，每个步骤都有一些注意事项，本文主要讲一下2个影响荧光WB成像最重要的因素：抗体的选择和成像系统的使用。

抗体的选择

在设计荧光蛋白质免疫印迹多重检测实验时，选择合适的一抗和荧光标记的二抗至关重要。对于一抗，要选择专门适用于WB的抗体，使用供应商提供靶特异性验证和确认的抗体，以确保抗体与正确的靶标结合并节省确认时间，比如Invitrogen 的高级验证抗体。

荧光二抗在选择需要注意的细节也更多，包括物种，荧光染料，交叉吸附等都是不可忽略的要素。

物种上，使用来自不同宿主的一抗标记每种待测靶蛋白，这有助于选择合适的二抗尽量减少潜在的抗体交叉反应性。如果难以区分一抗宿主，还可以根据抗体的类型（IgM或IgG，IgG1等）选择二抗。
还可以使用经交叉吸附的二抗。交叉吸附是指纯化后的二抗再次通过一个纯化柱，而该纯化柱上固定了其他种属的来源的抗体或者血清，有助于消除抗体混合物中的非特异性抗体，从而达到减少背景和提升抗体效价的目的。
在荧光染料选择上，首先应该选择激发或发射光谱不重叠的荧光染料。其次要考虑染料的亮度，使用灵敏度更高的荧光染料能帮助我们检测更低丰度的靶标，从而发现更多的可能。如Alexa Fluor染料，因其优越的稳定性和高亮度广泛得到认可。值得一提的是，在Alexa Fluor的基础上Invitrogen推出了Alexa Fluor Plus二抗，信噪比更高，尤为适用于多重WB成像检测低丰度靶点。如下结果展示，与传统 800 近红外染料相比，Alexa Fluor Plus 800 在较低稀释度下可显示更多条带，灵敏度更高和检测范围更广。

图1. 荧光蛋白质免疫印迹适用传统800 近红外二抗（下图）与 Alexa Fluor Plus 800 二抗（上图，羊抗兔 IgG 二抗，货号 A32735）检测热休克蛋白 90（Hsp90）和组蛋白脱乙酰酶1（HDAC1）的表达。

成像系统的滤光片与荧光染料的配适

在多色荧光WB中，理想的情况是，在消除荧光染料之间的任何干扰的条件下，单独捕获每种目标蛋白的条带，之后进行图像叠加。因此，有必要在检测开始之前了解你的成像系统的配置，最重要的是了解可用的激发和发射滤光片的波长范围。许多成像系统使用激发和发射滤光片的组合，可以选择这些组合形成窄谱范围，激发荧光染料，减少荧光通道之间的交叉干扰。滤光片的种类决定了可以进行哪些荧光成像，滤光片的品质又关乎可同时进行几种荧光成像。在不同的仪器中，可用的滤光片可能已安装或需要安装（有关iBright FL1500成像系统中预安装的滤光片，请参见表1）。使用具有荧光WB功能的成像仪，利用荧光光谱查看器（thermofisher.com/spectraviewer）等工具查看可用的荧光基团之间的激发和发射光谱叠加图，从而选择合适的荧光染料。图2显示了激发和发射光谱高度重叠的两个荧光基团的示例。图3显示了具有最小激发光谱重叠的荧光基团组合的示例。图4显示了具有最小发射光谱重叠的荧光基团组合的示例。

表1. iBright FL1500成像系统滤光片

图2. 明显光谱重叠的示例。上图为在线荧光光谱查看器生成的图像，该示例中，Alexa Fluor Plus 647和Alexa Fluor 680荧光基团的部分激发和发射光谱都在激发和发射滤光片的范围内，因此会同时激发两种荧光基团，此时，它们发射的荧光都会到达摄像头的探测器，导致难以区分检测到的荧光的来源。

图3. 具有不同激发光谱的荧光基团进行多重检测实验的示例。上图为荧光光谱查看器生成的图像，该示例中，Alexa Fluor Plus 488和Alexa Fluor 546荧光基团的激发光谱（虚线）在激发滤光片的范围内具有最小重叠。尽管两种荧光基团的部分发射光谱（实线）都在发射滤光片的范围内，但AlexaFluor 546不会被用于Alexa Fluor Plus 488的激发滤光片所激发，因此来自Alexa Fluor 546的荧光不会通过发射滤光片。

图4. 具有不同发射光谱的荧光基团进行多重检测实验的示例。上图为荧光光谱查看器生成的图像，该示例中，Alexa Fluor Plus 680和Alexa Fluor790的发射光谱（实线）在两种发射滤光片的范围内无重叠。尽管两种荧光团在激发滤光片1的范围内具有部分激发光谱（虚线）重叠，但在该激发范围内产生的任何Alexa Fluor 790荧光的波长都不能通过发射滤光片1，因此来自Alexa Fluor 790的荧光将无法到达该通道中的摄像头探测器。

看上去是不是有些复杂？如果使用iBright进行多色荧光WB，我们整理了不同靶标蛋白与荧光染料的对应关系，可以依据实际需求进行选择荧光染料选择。

表2.使用 iBright FL1500 成像系统实现 1 至 4多重检测的荧光基团方案示例。

小贴士：提示：使用iBright FL1500成像系统成像时，对于低丰度靶标蛋白，使用较亮的低波长荧光染料（例如，Invitrogen™ Alexa Fluor™ 546和Alexa Fluor Plus 647），相反，对于高丰度靶标蛋白，使用较高波长荧光染料（例如，Alexa Fluor Plus 680和Alexa Fluor Plus 800探针）。