2022年1月26日，欧易生物联合中国科学院青岛生物能源与过程研究所徐健教授团队、中国海洋大学王师教授团队在Genome Biology (IF: 18.01)上共同署名发表了题为“Species-resolved sequencing of low-biomass or degraded microbiomes using 2bRAD-M”的研究论文[1]，报道了一项全新的微生物组学测序技术——2bRAD-M®。该技术采用 IIB 型限制性内切酶对基因组酶切，获得等长的酶切标签（tag），回收tags建库测序，然后与自建的“物种特异性标签数据库”比对，通过“两步法”实现对微生物的定性和定量检测。
2bRAD-M®相较于传统的16S技术，优势明显，为让大家有更全面的认知，从以下几个方面进行对比介绍：
01
检测种类
16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基的基因，特异存在于细菌中，仅能用于检测细菌；2bRAD-M®自建的“物种特异性标签数据库”收录了将近8.6万个种水平的微生物共40万+个基因组（同一物种可能有多个版本的基因组），种水平上包含细菌80789个、真菌581个，古菌4416个。一次实验分析可同时检测三大类微生物，检测范围更广，适用于更多的科研场景。
02
分辨率
基于短读长测序的 16S 通常只能鉴定到属水平；2bRAD-M®数据库中收录的微生物都有种水平的注释，但凡是被检测到的微生物，都能提供种水平的信息，分辨率更高。
03
测序区域
绝大多数细菌的基因组大小在1-10Mb，16S rDNA基因全长约1500bp，包括V1-V9九个可变区，16S测序中使用较多的是V3V4区，扩增长度大约470bp，对大小为几Mb的基因组覆盖度极低，很难代表整个基因组的信息。
2bRAD-M® 技术，BcgI酶（IIB型内切酶的一种）可从数据库收录的40万+个微生物基因组中，平均每个基因组获得3010个等长(32bp) tags，这些tags在基因组中均匀分布（平均间隔3-4Kb），每个基因组种水平的unique tags占比约39.7%，数量达上千个，不论是基因组覆盖度还是基因组分布范围，都远优于16S，更能代表整个基因组。
04
偏好性
据不完全统计，16S可选的测序引物约有20对，对应不同的扩增区域，或者是对应相同区域但引物个别碱基有差异。PCR实验过程中，不同的引物存在扩增偏好性，导致相同样本不同引物的检测结果存在差异[2]，哪个结果才是准的？2bRAD-M® 技术不存在这个问题。
05
脱靶扩增（假阳性）
16S测序中容易出现脱靶扩增，扩增到非目标16S区域的信息，造成假阳性的发生。比如2021年发表于《Microbiome》上的一篇关于帕金森的研究论文中就指出，脱靶扩增到的人类或小鼠DNA序列会被错误地鉴定为细菌[3]。究其原因，一对引物，一条序列对物种的代表性是远远不够的。2bRAD-M®是基于全基因组范围内上千条unique tags进行的分析检测，结合特有的分析算法，能最大限度的降低假阳性。
06
技术重复性
Tags在基因组上的均匀分布、序列等长的特点保证了2bRAD-M®技术有较好的技术重复性，即使在面对三大类疑难样本（高宿主污染、严重降解、低生物量）2bRAD-M®仍表现极佳，每小组三个生物学重复样本的平均L2相似性达到了95.4%[1]。好的技术重复性，才能保证结果的稳定可靠。
07
外源污染
众所周知，微生物相关实验极易引入外源污染，为尽可能的降低污染，欧易生物在实验环节为2bRAD-M®项目配备了专用的准P2级别实验室，有严格的功能分区，在生信分析方面，配套有生信去污染分析流程。尽最大努力确保获得更加真实、客观的结果。
2bRAD-M®与16S的技术对比总结如下：
2bRAD-M® | 16S | |
检测种类 | 细菌、真菌、古菌 | 细菌 |
分辨率 | 种水平 | 属水平 |
测序区域 | 遍布整个 基因组的标签 | 只检测16S 的部分区域 |
偏好性 | 无 | 不同引物间 存在偏好性 |
假阳性 | 低 | 高 |
技术重复性 | 高 | 低 |
分析内容展示
项目经验
目前已与约110家单位建立合作，样本数量近15000例。其中做过的部分样本类型：
部分合作单位
案例文章
案例一[4]：幼儿园微生物群落的种水平解析（点击标题查看文章解读）
英文标题：Species-Resolved Metagenomics of Kindergarten Microbiomes Reveal Microbial Admixture Within Sites and Potential Microbial Hazards
期刊：frontiers in Microbiology
IF：6.064
作者单位：新加坡宝洁创新中心
样本：游戏室灰尘、厕所地板、游戏室地板、书包、玩具表面、图画书、彩色铅笔、手掌，共114例
取样：地板，无菌拭子无菌去离子水湿润，8cm×8cm区域横向和纵向涂抹20次。
彩色铅笔和玩具表面，擦拭拭子以覆盖整个表面。
儿童，洗手前用拭子擦拭双手的整个手掌。
室地板灰尘，沿游戏室地板边缘进行2分钟的吸尘器灰尘收集
研究思路：
研究结论：
幼儿园种水平上的微生物组成分析
七个采样地点与儿童手掌样本之间的微生物相关性
幼儿园表面存在的潜在有害微生物
本研究首次采用2bRAD-M®技术，克服了室内环境样本中微生物群落生物量低的挑战，建立了幼儿园室内微生物群落的无偏图，以及室内场所与人类居民之间的微生物传播。这使得幼儿园表面细菌混合的推断成为可能，这可能是通过与孩子们的手接触来实现的。具有潜在人类健康问题的细菌种类和耐药菌主要集中在儿童的手上，而不是在环境场所，这突出了幼儿园良好的手卫生习惯的重要性。
文章解读回放：
案例二[5]：2bRAD-M®解析单侧肾结石患者的肾盂尿微生物组（点击标题查看文章解读）
英文标题：The renal pelvis urobiome in the unilateral kidney stone patients revealed by 2bRAD-M
期刊：Journal of Translational Medicine
IF：8.440
作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院
病例数：30位（结石侧、非结石侧分别取样，共60例样本）
取样：将输尿管镜插入肾盂结石中，将输尿管导管放入肾盂内收集肾盂尿液
收集5ml尿液，尿液样本在收集后1小时内存放在−80℃下。整个过程在无菌条件下进行。
研究思路：应用2bRAD-M®对单侧肾结石患者的肾盂微生物组进行分析，比较有结石和无结石患者的泌尿菌群差异。
研究结论：
2bRAD-M®首次进行单侧肾结石微生物研究。总的来说，肾盂有结石和无结石的泌尿系统菌群组成相似。结石侧棒状杆菌水平升高，普雷沃氏菌和乳酸杆菌水平降低，非结石侧P. bivia, L. iners, C. aurimucosum，和P. sp_286富集。有些种可用于区分结石侧和非结石侧，具有较高的准确性。
文章解读回放：
2bRAD-M®现针对“粪便/肠道内容物样本/水滤膜/土壤”这几类样本推出促销活动，让大家可以用较低的成本，种水平上获得三大类微生物的信息。
样本准备
*参与本次促销的三类样本要求如下
样本类型 | 建议保存 |
粪便/肠道内容物 | ≥500mg |
土壤 | ≥2g |
水滤膜 | 直径 3-5 cm 滤膜 2 张（可见附着物） |
注：其他样本类型也可做，但不参与本次促销
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电话｜17362231864 （王经理）
邮箱｜qdmraket@oebiotech.com
参考文献
[1] Sun Z, Huang S, Zhu P, et al. Species-resolved sequencing of low-biomass or degraded microbiomes using 2bRAD-M[J]. Genome biology, 2022, 23(1): 36.
[2] Thijs S, Op De Beeck M, Beckers B, et al. Comparative evaluation of four bacteria-specific primer pairs for 16S rRNA gene surveys[J]. Frontiers in microbiology, 2017, 8: 494.
[3] Bedarf J R, Beraza N, Khazneh H, et al. Much ado about nothing? Off-target amplification can lead to false-positive bacterial brain microbiome detection in healthy and Parkinson’s disease individuals. Microbiome. 2021; 9: 75[J].
[4] Lam T H, Chew D, Zhao H, et al. Species-resolved metagenomics of kindergarten microbiomes reveal microbial admixture within sites and potential microbial hazards[J]. Frontiers in microbiology, 2022, 13.
[5] Hong S Y, Yang Y Y, Xu J Z, et al. The renal pelvis urobiome in the unilateral kidney stone patients revealed by 2bRAD-M[J]. Journal of Translational Medicine, 2022, 20(1): 431.
上海欧易生物医学科技有限公司（简称：“欧易生物”），成立于2009年，经过十多年稳健发展，已经成长为拥有“晶准生物”“鹿明生物”“青岛欧易”三家全资子公司，近600名员工的生物科技领域集团型企业。
欧易生物始终秉持着“硬数据 · 好服务”的理念服务于大众。为大生命科学、大健康相关研究领域，以及医药、食品及日化企业的客户，提供从基础研究到药物靶点发现、药理药效及安全性评价、疾病分子标志物筛选、致病菌及耐药菌溯源等相关技术服务，全力加速客户研究与开发进程，提升客户研究与开发价值。
欧易生物携手旗下子公司，实现了中心法则上、中、下游多层组学的串联，从基因组、转录组、表观组、微生物组，到蛋白组、代谢组及近年热门的单细胞&空间多组学技术服务，为科研用户提供全面的创新多组学技术服务。
欧易生物已先后获得闵行区研发机构、闵行区企业技术中心、上海市科技小巨人企业、产权管理体系认证企业等资质。拥有授权发明专利30+项，在受理发明专利50+项，软件著作权150+项。
青岛欧易立足生命科学，开发先进技术，为国内生命科学领域提供从基因组研究、遗传分子标记开发，到微生物多样性检测等系列高端技术服务。公司与国内科研机构、高校、药企、食品及化妆品企业密切合作，积极推动基因组学技术在各领域的广泛应用。公司拥有基因组组装、基因组重测序、外显子捕获等组学技术，同时拥有简化基因组测序（2b-RAD）、简化基因组甲基化测序（MethylRAD）、简化宏基因组测序（2bRAD-M®）等特色技术。协助客户在生物的遗传性状解析、分子标记辅助选择育种、基因组选择育种、种质资源鉴定与保护、群体基因组学研究、表观遗传学研究、微生物组检测及工业应用等方面提供解决方案。
END
排版人：小久
原创声明：本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载。
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