既要，又要能成为现实吗？
理想的Western成像：不论高低丰度的目标蛋白均有清晰条带，没有过曝，线性度好，背景干净。
现实的Western成像：由于中丰度到高丰度的蛋白质在western上比低丰度的蛋白质具有更高的信号，曝光时间过短 – 中高丰度蛋白条带清晰，但是低丰度蛋白质条带隐隐约约，增加曝光时间 – 低丰度蛋白条带清楚了，但是中、高丰度蛋白质的信号饱和，条带变得又黑有宽，好像蜡笔小新的眉毛！
怎么办呢？
除了不断优化曝光时间，还有什么可以省（yi）时（lao）快（yong）速（yi）的方法吗？
可以试一试iBright 成像系统新升级的功能：Smart Range HDR！
线性度怎么样呢？
图1. Smart Range HDR功能将短曝光和长曝光结合到单个HDR图像中，增加了线性动态范围。采用Smart Exposure可快速获取条带，但是低丰度不明显；长期曝光可以增加低丰度蛋白的条带深度，但是中、高丰度蛋白出现了过曝（红色表示过曝），Smart Rang HDR将两者结合起来，既能获得清晰的低丰度蛋白，又能减少中、高丰度蛋白的过曝，其线性度更好。
图2. 与Smart Exposure功能相比，Smart Range HDR功能将p23的检测极限提高了4倍。HeLa裂解液在样品缓冲液中依次1:1稀释(从20 μg到10 ng)，制备SDS-PAGE，在Invitrogen™Novex™WedgeWell™4-20% tris -甘氨酸凝胶上电泳。将蛋白转移到硝化纤维素膜上，检测p23。使用Smart Exposure和Smart Range HDR功能在iBright成像系统上进行western blot成像。通过(A)视觉评估和(B)有多少数据点落在线性动态范围内对图像进行比较。图中省略了20 μg的数据点，因为它落在两个参数的线性范围之外。
实际用起来，又有哪些帮助呢？
图3. 与Smart Exposure功能和长时间曝光(过度曝光)图像(未示出)相比，Smart Range HDR拍摄的图像具有更多细节，最低信号带现在可在背景上区分，最高信号带不饱和。A431细胞未处理对照， hEGF处理， hEGF加PD168393(急性EGFR抑制剂)处理。细胞裂解后进行SDS-PAGE检测。从每个样品中抽取10 μg，分三次加入两个12孔Novex WedgeWell 4-20% tris -甘氨酸凝胶中。将蛋白转移到硝化纤维素膜上，然后切成3条相同的条带，每个条带具有相同的样品布局，用Pierce™Clear Milk Blocking Buffer孵育，然后检测EGF受体途径和p23(管家蛋白)中的4种不同的磷酸化蛋白。四种不同的印迹与HRP二抗孵育，洗涤，然后使用SuperSignal West Dura发光液。(A)利用smart Exposure和Smart Range HDR功能，在iBright FL1500成像系统上进行成像。(B) 磷酸化蛋白数据归一化使用管家蛋白p23进行。
在上面的例子中(图3)，与单独使用Smart Exposure功能捕获印迹信号相比，Smart Range HDR功能显著提高了对低表达磷酸化蛋白的检测。SmartRange HDR图像具有更多细节，最低信号带在背景之上可区分，最高信号带不饱和。结果的扩展可以实现更可靠的整体数据解释。
需要注意的是：蛋白样品种类万千，不是所有的样品都适合采用Smart Rang HDR。如果你的目标蛋白丰度差异不大，Smart Exposure就能给出准确的曝光时间，且能迅速完成曝光，就没有必要动用Smart Rang HDR功能啦。
想要试用下iBright成像仪的这个功能
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希望你的蛋白也能被“看”的清清楚楚！
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