表皮是一个多层组织，在保护机体免受水分流失、外来生物、紫外线和有害病原体的侵害方面起着至关重要的作用，特别是表皮的最外层——角质层（SC），提供了一个渗透性屏障，防止水分和电解质的流失，这种屏障功能的基本介质包括神经酰胺、胆固醇和长链脂肪酸类代谢物，它们的改变有可能导致人类皮肤疾病，包括牛皮癣和特应性皮炎。人锌指(C2H2型)蛋白ZNF750是一种参与终表皮分化和癌症的转录因子，此前有研究证实ZNF750基因的移码突变可引起脂溢性皮炎。
2023年4月，意大利罗马第二大学的研究团队、贾伟教授等多个团队共同在Science Advances (IF=14.957)期刊发表题为“ZFP750 affects the cutaneous barrier throughregulating lipid metabolism”的研究论文，揭示了ZFP750作为皮肤发育的关键转录因子，直接和/或间接调节神经酰胺生物合成关键酶的表达，对皮肤屏障通透性至关重要，这将有助于了解几种人类皮肤病的发病机制。（贾伟教授作为本文共同作者之一，且本研究中脂质组检测分析由麦特绘谱协助完成）
1. 转录因子ZFP750在体内的作用
如图1 所示，构建基因敲除（KO）小鼠模型，导致Zfp750 mRNA有效降低。出生后，Zfp750−/−小鼠的皮肤有光泽、皱纹和粘性，眼睛已经睁开。妊娠第16.5天（E16.5），眼睑明显缺失。此外，与对照组相比，Zfp750−/−小鼠的体重有所减轻，并在20小时内死亡。而杂合小鼠Zfp750+/−未表现明显的表型，与WT小鼠相似。皮肤屏障功能分析显示，与对照组相比，Zfp750−/−小鼠的表皮厚度减少，角质层（SC）紧密压实，出生后9小时内体重下降了15%。体重减轻是由于皮肤渗透性屏障功能受损导致的脱水，通过使用甲苯胺蓝排除法评估了由外到内的渗透性屏障，皮肤屏障功能的改变也由内到外紧密连接屏障试验证实。这些结果表明，Zfp750−/−小鼠在出生后不久死亡，并显示出“由外向内”和“由内向外”皮肤屏障功能的严重改变，从而导致脱水，表明ZFP750在皮肤渗透性屏障中起着至关重要的作用。
图1. Zfp750−/−小鼠皮肤屏障功能的改变
2. Zfp750−/−小鼠皮肤发育受损
在人角质形成细胞中，ZNF750既是祖基因的抑制因子，也是分化基因的激活因子。研究人员评估ZNF750在发育中的作用，分析了其缺失对角质形成细胞增殖的影响，以及对基底层(Krt14阳性细胞)向棘层(Krt10阳性细胞)转移的影响。分析发现在Zfp750−/−小鼠的表皮中，观察到几个细胞Krt14和Krt10都呈阳性，这表明ZFP750的缺失延迟/损害了早期分化阶段的角蛋白开关，Krt14 mRNA表达的增加也说明了这一点，并使小鼠表皮的增殖率显著增加。进一步分析表明p63和ZFP750在表皮发育过程中协同作用，涉及p63-ZFP750和KLF4的调控轴在小鼠皮肤发育中并不完全保守。
ZNF750也参与控制表皮晚期分化基因的表达。随后分析屏障缺陷与角化包膜蛋白成分的表达改变的关系，发现与WT小鼠相比，Zfp750−/−新生小鼠中受ZNF750调控的丝聚蛋白和兜甲蛋白（loricrin）表达下调，同时内披蛋白（IVL）上调。这可能是由于组织试图恢复屏障功能。
3. Zfp750−/−小鼠脂质屏障组成改变
通过免疫荧光分析定位神经酰胺（Cer）和葡萄糖神经酰胺(GlcCer)，发现对照组小鼠中GlcCer/Cer主要定位于SC层和颗粒层，而在Zfp750−/−小鼠皮肤SC中完全不存在。
尼罗红染料分析SC的脂质组成，在从对照小鼠分离的SC中有极性和非极性脂质的存在（明亮的金黄色）；相比之下，在Zfp750−/−小鼠的SC中，这两种脂质的存在都明显减少，这种减少对于非极性脂质(Cer，绿色荧光)更为明显。分化3天后，来自Zfp750−/−小鼠的角质细胞也证实了非极性脂质的减少。
此外，WT小鼠的脂质呈织状分布，而Zfp750−/−小鼠的SC中的脂质呈珍珠状分布，透射电镜分析也证实了SC中脂肪的点状分布。WT小鼠超微结构分析显示，颗粒层与SC之间的界面充满片状体(LBs)，呈椭圆形囊泡；相比之下，Zfp750−/−小鼠的界面几乎没有LBs。Zfp750−/−小鼠表皮中的酶原和酶活性形式均显著减少，进一步证实Zfp750−/−小鼠中LBs的减少。
这些结果表明，ZFP750的缺失会改变表皮脂质组成，从而导致皮肤通透性屏障功能障碍。
图2. Zfp750−/−表皮脂质组成异常
4. ZFP750调节角质化包膜相关蛋白和脂质成分的基因表达
小鼠表皮总RNA测序分析显示，ZFP750基因缺失导致1722个基因表达改变，负责角化、细胞迁移和增殖过程的978个基因被上调，特别是参与角化过程的基因Krt2、Krt6b、Sprr1b、Sprr2d等，这可能是由于ZFP750缺失后分化程序的失调。此外，缺失ZFP750还导致编码胆固醇酯（CE）晚期分化标记和前体的几个基因下调，包括Lce1i、Lce1h、Lce1l和Lce1m。相反，Zfp750−/−表皮中有744个基因下调，基因本体（GO）分析显示脂质代谢和角质细胞分化相关通路富集。其中55个参与脂质代谢的基因(Degs1、Degs2、Sgpl1、Elovl6、Elovl7和Kdsr)的表达在Zfp750−/−小鼠皮肤中被抑制。这些结果表明，转录因子ZFP750通过控制参与角化细胞包膜蛋白和脂质成分组装的基因表达来调节表皮发育。
图3. Zfp750基因缺失会导致参与脂质代谢、角质细胞分化和角质形成的基因失调
5. ZFP750是表皮神经酰胺代谢的关键调节因子
表皮神经酰胺及其相应的代谢物在皮肤屏障完整性的形成和维持中起着至关重要的作用。含有极长链(VLC)和超长链(ULC) FAs的神经酰胺的从头合成始于表皮自旋/颗粒层的内质网(ER)，第一步是丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)使棕榈酰辅酶A和L-丝氨酸缩合；这些生物合成途径是在Zfp750−/−小鼠表皮中特有的。Sptlc1亚基和3-酮二氢鞘氨醇还原酶(Kdsr)的表达显著降低，并且分别催化二羟基神经酰胺和神经酰胺生成的神经酰胺合成酶(CerS)和去饱和酶(Degs)的表达因缺失ZFP750而失调。
神经酰胺的FA成分VLC和ULC FAs是在角质形成细胞的内质网中合成的，它们的合成由7个酶组成的家族介导，称为VLC FAs延伸1至7 (Elovl1至Elovl7)，该家族催化了构成长链FA延伸循环的四个反应中的第一个反应和限速反应。观察到在WT组动物角化细胞分化过程中Elovl6的表达增加，Zfp750−/−小鼠中Elovl7的表达部分降低。另一方面，二酰基甘油酰基转移酶（Dgat2）和中性鞘磷脂酶(Smpd3)在Zfp750−/−角化细胞分化过程中的表达上调被抵消。这些结果表明ZFP750是控制脂质角化包膜形成过程中关键酶表达的转录因子。
图4. ZFP750控制神经酰胺生物合成相关基因的表达
6. Zfp750−/−小鼠表皮脂质成分失调
进一步验证，对小鼠表皮进行脂质组学分析，结果显示，在皮肤屏障通透性中起关键作用的神经酰胺类的数量严重失调，特别是饱和神经酰胺(d18:0/16:0)、(d18:1/16:0)、(d18:0/24:0)、(d18:0/26:0)均有显著的积累。相反，在Zfp750−/−小鼠表皮中，C24-26单不饱和神经酰胺显著减少，如(d18:1/24:0)、(d18:1/25:0)、(d18:1/26:0)和(d18:1/26:1)。这种变化可能是神经酰胺生物合成中涉及的关键酶的mRNA水平降低的结果。在哺乳动物细胞中，大多数神经酰胺也通过鞘磷脂合成酶转化为鞘磷脂。由于几种神经酰胺种类的数量减少，还观察到突变小鼠表皮鞘磷脂的显著减少。
表皮中性脂质代谢在维持皮肤适当的渗透性屏障方面也起着关键作用。分析显示，从Zfp750−/−小鼠表皮中甘油三酯(TAG)的数量显著减少，这与突变小鼠表皮中几种1,2-二酰基甘油的显著增加有关。
胆固醇是表皮的重要组成部分，胆固醇酯（CE）的极性比游离胆固醇低，可以增强皮肤的疏水性，促进屏障功能。特别是新生小鼠的表皮主要含有CE和C16-18 FA。突变小鼠表皮的胆固醇酯(C16-18)水平显著降低。
LB中所含的磷脂在角质层SC中代谢为游离FAs，这反过来又有助于SC的酸化。研究表明，ZFP750是磷脂的适当生物合成所必需的。具体来说，Zfp750−/−小鼠表皮中磷脂，即磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的含量明显失调，包括醚键在内的几种磷脂酰丝氨酸在Zfp750−/−小鼠表皮中有明显的积累，同时发现少数磷脂酰肌醇减少。
因此，脂质组学分析证实了关键角化细胞特异性脂质的减少，证明了ZFP750在表皮中允许合成适当脂质屏障方面的相关性。
最后，研究人员通过小干扰RNA (siRNA)抑制ZNF750在人角质形成细胞中的表达评估ZNF750对表皮脂质代谢的调节是否在人类中也保守，分析显示Degs1、Degs2、Dgat2、Smpd3、Elovl6和Elovl7 mRNA水平显著降低，它们的失调与非极性脂质水平显著降低有关。ZNF750直接和/或间接调控表皮脂质合成关键酶的表达。
图5. Zfp750基因缺失导致表皮脂质组成受损
小结
综上，本研究确定了人锌指(C2H2型)蛋白ZFP750是表皮屏障功能的主要调节剂，通过控制参与几种表皮脂质合成酶的表达来控制表皮脂质组成，这将有助于了解几种人类皮肤病的发病机制。
图6. ZFP750作为表皮脂质生物合成的主要调节因子
原文信息
Butera A, et al. ZFP750 affects the cutaneous barrier through regulating lipid metabolism. Sci Adv. 2023.
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