基于JEOL GrandARM及4D STEM的冷冻电子叠层衍射成像技术

JEOL

2023.8.07

作者日本电子

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基于JEOL GrandARM及4D STEM的冷冻电子叠层衍射成像技术

Cryo EPty-SPA

近日，英国华威大学王鹏教授课题组联合英国牛津大学Angus Kirkland，David Stuart 和Peijun Zhang教授课题组，率先发展了基于冷冻电子叠层衍射成像的单颗粒三维重构技术（Cryogenic electron ptychographic single particle analysis, cryo-EPty SPA），并首次提出相关技术流程图。该研究工作在具有冷场电子枪的JEOL GrandARM电镜上（标配冷场电子枪,能量发散度小于0.35eV）开展实验，采用冷冻电子叠层衍射成像（cryo-EPty）技术重构获得轮状病毒颗粒高衬度二维图像，再通过单颗粒三维重构技术获得病毒颗粒的三维密度图。研究结果表明，相对于传统TEM，基于电子叠层衍射成像技术的单颗粒三维重构结果的衬度更高；不同电子探针会聚角会得到相应的优势信息传输频带，通过组合不同会聚角的优势频带，获得了宽频带的三维密度图。该研究成果以“Cryogenic electron ptychographic single particle analysis with wide bandwidth information transfer”为题，在Nature Communications上发表（DOI：10.1038/s41467-023-38268-0），南京大学博士生裴旭东、博士后周丽旗，牛津大学黄琛博士为该工作的共同第一作者。

冷冻电镜技术已迅速发展成为能实现生物分子原子级高分辨结构解析的主流研究手段。采用透射电子显微成像对生物大分子如病毒、蛋白质等弱相位物体进行成像时，成像衬度弱是其面临的主要问题之一；且生物分子极易受电子辐照损伤，只能在极低电子剂量条件下进行成像，因此成像信噪比低。传统TEM成像通过增加一定欠焦量可有效增强成像衬度，但同时会降低成像分辨率；并且，传统 TEM成像存在衬度反转，同时在特定频率上存在衬度传递零点，即信息丢失。这些因素使得单颗粒三维重构中颗粒挑选十分困难，同时也增加了欧拉角对齐和颗粒分类的难度。为了解决传统冷冻电镜成像技术中低衬度和低信噪比的问题，需要发展新型高衬度且信噪比高的成像方法。

电子衍射叠层成像（Ptychography）不依赖于物镜硬件成像，而是通过采集4D STEM衍射数据，再利用计算机算法进行重构成像的新型技术。该技术凭借其超高分辨、高相位衬度、适用于轻质元素、高电子剂量效率以及易于三维成像的独特优势，已在材料领域发展成熟并得到了广泛应用。王鹏教授团队率先将该技术发展应用至生物样品的成像，在其2020年发表的研究成果中（DOI：10.1038/s41467-020-16391-6），该团队发展了冷冻电子叠层衍射成像技术（cryo EPty），该技术的具体流程如图1所示，该团队利用该技术实现了冷冻病毒颗粒在低剂量条件下的高衬度二维成像，并展示了该技术具有高衬度、高剂量效率、且能实现微米级大区域成像，其带宽灵活可调，不存在衬度翻转和衬度缺失。

图1.冷冻电子叠层衍射成像(cryoEPty)光路及流程示意图

在该工作的二维成像基础之上，该团队继续在本研究中实现了cryo EPty与单颗粒三维重构技术的有机结合，展示了基于cryo EPty的单颗粒三维重构技术的流程，实现了病毒颗粒的三维重构，并对比了基于cryo EPty和传统TEM两种方法所获的的三维重构质量。

Cryo EPty-SPA的技术流程分成4步，图2所示为第一步和第二步。第一步是二维图像的获得，采用离焦汇聚电子束扫描冷冻样品（如图a,b），同时使用直接电子探测器采集每个扫描点上的衍射图像（如图c），再采用ePIE算法对四维数据集进行重构获得样品的二维振幅（图d）和相位图像（图e）。值得注意的是，本研究采用的是离焦电子叠层衍射成像，是一种后聚焦成像方式，即数据采集时无需对焦，而是在数据重构过程中实现精准对焦，这可减少实验数据采集过程中的对焦操作，可有效降低由此产生的电子束辐照损伤。第二步是单颗粒挑选。可同时从振幅图像及相位图像分别提取出单颗粒数据，其中振幅图像中的颗粒可用于生成初始3D模型，必要时还可利用振幅图像颗粒坐标辅助相位图像中的颗粒挑选。第三步是单颗粒三维重构，与传统TEM SPA步骤相同。第四步是多带宽组合（Multi-band Fourier Synthesis）,Cryo-EPty SPA在不同会聚半角条件下获得的三维密度图具有不同的信息传递优势频段，多带宽组合即组合不同会聚半角条件下的优势频带，从而获得宽频带三维密度图。

图 2. Cryo EPty-SPA 与 TEM SPA流程示意图

该团队研究了不同会聚角（如图1中光路示意图中入射半角α

）大小（1.03 mrad, 3.26 mrad, 4.83 mrad）对Cryo EPty-SPA三维重构结果的影响，结果如图3所示。由（a-c）相位图像可知，Cryo EPty所得的二维图像的分辨率随会聚角的增大而提高，而成像衬度随会聚角的减小而逐渐提高；对比传统TEM二维图像如3(e),Cryo EPty所得的二维图像衬度比TEM 衬度高。基于二维相位图像，研究人员采用Relion3.1进行单颗粒三维重构，不同会聚角条件下选用的颗粒数量仅为200-300个。在较小会聚角条件下(1.03 mrad)轮状病毒颗粒轮廓及表层壳粒层中260个VP6的排布得到了清晰呈现,随角度的增大,三维重构结果的分辨率逐渐升高,如图3(h),4.83 mrad条件下，VP6三聚体中的三个单体清晰可见。

图3 轮状病毒颗粒的cryo EPty-SPA在不同会聚角条件下的三维重构实验及模拟结果与传统TEM-SPA的三维重构结果的对比。(a-d)不同条件下二维重构相位图像中单个颗粒示例；(e)TEM二维图像单个颗粒示例；(f-j)不同条件下重构所得病毒颗粒的三维密度分布图；(k-o)不同条件下病毒颗粒三维密度图上VP6单体的局部放大图;(p-t)不同条件下病毒颗粒三维密度图的Z向中间切片展示。标尺：(e, j, t)为25 nm,(o)为2.5 nm。

研究者进一步对三维重构质量进行了定量分析，通过FSC曲线可得，Cryo EPty-SPA在三个不同会聚角条件下的分辨率分别为3.72 nm、3.29 nm和1.86 nm（会聚角从小到大），而TEM SPA在相近颗粒数目条件下获得的三维重构的分辨率为2.09 nm。值得注意的是，研究人员通过数值模拟表明， Cryo EPty-SPA的分辨率的提升空间很大，本研究中的分辨率主要受限于数据采集过程中存在明显的样品漂移。通过绘制不同三维重构结果的三维功率谱密度曲线图4(b)，研究人员发现不同会聚角存在相应的优势频段，如1.03的优势频段为黑色曲线所在频段范围，而4.83 mrad的优势频段为蓝色曲线所覆盖的频段范围。因此，研究人员通过多频带组合实现了不同会聚角条件下优势频带的有机结合，获得宽频带三维密度图4(c)。

图4. Cryo EPty-SPA多带宽组合三维结果。Cryo EPty-SPA在不同会聚角条件下的重构结果的FSC曲线（a）和三维功率谱密度曲线 (b)；(c) 由不同会聚条件下Cryo EPty-SPA重构结果的优势频段组合而成的宽频带三维密度图，标尺为25 nm。

最后，研究人员进一步对Cryo EPty-SPA实现原子分辨的三维重构进行了展望，通过数值模拟的方法，在会聚角为15 mrad、电子剂量为73.24 e/ Å²、B-factor -65 Å²，颗粒数目为 2826的条件下，对去铁蛋白颗粒（Apoferritin）进行三维重构，分辨率为2.2 Å，已达原子分辨。

综上，该研究工作展示了Cryo EPty-SPA这一新技术的具体实现流程、技术优势及应用潜力、所面临的挑战以及未来的努力方向。相较于传统TEM SPA，Cryo EPty-SPA具有更高的成像衬度和电子剂量效率，将有助于小分子蛋白的三维结构解析。EPty的分辨率可突破电镜物镜硬件限制，理论上可实现比TEM 成像更高的分辨率，而目前该技术的分辨率受限于在数据采集过程中出现的不稳定性如电子束和样品之间相对漂移等，减小或校正样品漂移是未来的努力方向，比如通过发展针对Cryo EPty的漂移校正算法或者采用更为高速的探测器进行数据采集；Cryo EPty是一种扫描成像模式，可同时实现大区域高分辨二维成像，不受相机大小限制；Cryo EPty是后聚焦的方式，即在重构过程中进行进准聚焦，并可消除低阶像差；Cryo EPty可以同时获得样品的振幅和相位图像，这为三维重构中单颗粒挑选、初始模型的生成提供了更充足的数据。此外，EPty可通过逆多层法（inverse multi-slice method）实现厚生物样品的三维成像，该技术有助于解决样品太厚而引起的多重散射问题。为帮助解决Cryo EPty成像中样品漂移导致的分辨率受限的问题，JEOL推出了基于pnCCD技术的4D Canvas高速相机。该相机具有每秒7500帧的高速采集能力，单电子信噪比高达300:1，可以大大提高Cryo EPty成像的数据采集效率，减小样品漂移，进而提高成像分辨率。

因此，在未来的电镜相关硬件、技术及软件的进一步的发展，如电镜系统稳定性的提高，计算机算法的发展（如机器学习算法的引入），超快相机的发展以及超快电子光源的引入，Cryo EPty-SPA将为生物结构解析提供新的技术思路，有助于突破冷冻电镜技术在实际应用过程中存在的瓶颈或发展成为生物结构三维成像的通用技术。

本文由南京大学周丽旗博士、博士研究生裴旭东，华威大学（The University of Warwick）王鹏教授供稿。王鹏教授课题组研究和发展电子叠层衍射成像技术已达十年有余，取得了一系列突破性成果，如需了解更多，请访问https://warwick.ac.uk/fac/sci/physics/staff/academic/pwang/ 。