细胞治疗与基因治疗行业目前正在蓬勃发展，每个新药走上临床都需要经过IND申报，在进行IND申报则必须要对产品质量控制的检测方法进行开发和验证，不论是委托第三方检测，还是独立完成，都需要根据2020药典标准完成以下几个项目的验证：专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。由于分析方法具有各自的特点，并随分析对象而变化，因此需要视具体情况拟订验证的指标。
我们以qPCR方法为例，来聊一聊如何设计实验获得数据完成这些验证项目。
1、专属性Specificity
专属性是指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力。如方法专属性不强，应采用多种不同原理的方法予以补充。
鉴别反应、杂质检査和含量测定方法，均应考察其专属性。
对于qPCR方法来说，需要设置阴性对照，阳性对照，空白对照，在阴性对照和空白对照无Ct值，阳性对照有效扩增的情况下，方才认定专属性成立；
2、准确度Accuracy
准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。
根据准确度数据要求，有两种方案。
第一种在线性范围内，取同一浓度（相当于100%浓度水平）的供试品，用至少6份样品的测定结果计算回收率进行评价。
第二种方案在线性范围内，设计高中低3种不同浓度，每种浓度分别制备3份供试品进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。
两种方法的选定应考虑分析的目的和样品的浓度范围。对于有关物质检查的准确度，还需对定量限水平的准确度进行评价。
对于qPCR方法来说，准确度的要求一般为回收率50~150%；这一验证项目里，可能出现挑战的在于低浓度样本，因此需要一个灵敏度高，数据重复性好的仪器来进行实验。
3、精密度Precision（包括重复性Repeatability、中间精密度Intermediateprecision和重现性Reproducibility）
重复性是指在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。
（如上图所示，左边的图精密度良好，但是准确度不符合要求；右边的图平均值的准确度符合要求，但是精密度较差）
重复性数据要求：在规定范围内，取至少6份同一浓度（分析方法拟定的样品测定浓度，相当于100%浓度水平）的供试品，即实测样品，进行评价；或根据线性范围，设计3种不同浓度，每种浓度分别制备3份供试品进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。
注意，对于qPCR方法来说，这6份样品或9份样品需要在同一次实验进行。
中间精密度是指在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度。中间精密度是考察随机变动因素对精密度的影响，注意控制变量，每次只能验证一个项目。
重现性是指在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度。在分析方法从研发实验室转到QC实验室的过程中，通常会进行重现性的考察。
含量测定和杂质的定量测定都需要考察方法的精密度。
精密度数据要求：对于qPCR方法，需要提供相对标准偏差RSD，计算公式如下，样品中待测定成分含量和精密度RSD可接受范围请参考ChP2021版中9101中可接受范围表。
使用qPCR方法进行绝对定量时，要求RSD≤30%，这一要求不仅针对最终定量数据，对于仪器本身提供的Ct值的RSD也需要控制，仪器会提供一个SD值作为Ct值的精密度参考，一般以0.25为限。
德国耶拿定量 PCR 仪在外源性宿主 DNA 残留检测方面有很多的实际应用案例，客户的使用体验反馈有：
l 仪器检测灵敏度高
l 实验数据的重复性好
l 运行速度快
l 中文软件很好用
l 仪器运行很安静
分析方法验证介绍未完待续……
有兴趣的客户可在线留言或扫描以下二维码
首页
