干细胞“飞”凡解读之iPSC三胚层分化能力篇

糖尿病是一种严重威胁患者健康的慢性疾病，一直缺乏有效的治愈手段。而干细胞治疗则被认为在治疗1型糖尿病中具有极大地应用前景。近年关于使用iPSC衍生的功能性β细胞研究取得了显著的进展。其基本策略是重演了胚胎时期多能干细胞分化的主要路径：形成明确的内胚层，然后胰腺内胚层，再到内分泌前体细胞（祖细胞）并最终形成胰岛细胞 。

而如何精准诱导iPSC向内胚层分化是其中至关重要的一步。

在一项iPSC衍生的胰腺祖细胞研究中，作者从文献中选择了5种方法在Essential 8 培养基或KSR/MEF培养基中诱导PSC定向分化为内胚层，并进一步采用6种方案评估其分化为胰腺祖细胞的能力。为了评估体外内胚层定向分化的能力。研究人员使用流式细胞术对CD117 和 CXCR4这两个内胚层分化表面标志物进行了检测。同时，作者对比了KSR/MEF 和E8培养基在分化效率的区别。结果表明在DE4和DE5的培养方案下KSR/MEF培养效果较差，细胞几乎完全死亡。而在DE1-3方案中，两者效果相近。这表明不同的培养基条件，对于干细胞的诱导分化具有重要影响，尤其是在内胚层这样的关键分化步骤中。

Fig.1 PSC differentiation to definitive endoderm

进一步地，研究人员又比较了KSR/MEF 或 E8 培养基中 PSC 从 内胚层 分化到表达PDX1细胞的能力（PDX1 控制胰腺的胚胎期发育，存在于正常成熟胰腺的β细胞中）。通过流式细胞术检测表明使用方案5和6中E8培养基诱导细胞分化的效率更高。而KSR/MEF培养基在各个方案中变异系数较大。因此为了保持研究结果的稳定性，研究人员仅采用了E8培养基用于后续的研究。

Fig.2 Differentiation from DE to PDX1+ presumptive pancreatic endoderm.

心脏病可能是我们日常听过最多的医学名词之一。心脏作为第一个在发育过程中形成的功能性器官，也是最难在体外建立模型的器官之一。目前通过一些动物以及干细胞模型的研究工作，科学家们对于心脏谱系在胚胎中胚层中的命运决定方式已经有了一定认识，主要包括心肌细胞（Cardiomyocytes，CMs）、心内膜细胞（Endocardial cells， ECs）以及心外膜细胞（Epicardial cells）。

Nature Biotechnology在2021年发表了一篇题为《Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development》的研究性文章。在文中，研究人员构建了一个高度结构化的复杂三维心脏形成类器官 (HFO)，为研究早期心脏发育提供了新的研究方案。

近年来关于使用干细胞构建心脏类器官的研究曾出不穷，然而这些研究并未涉及早期心脏发育的时空模式，包括与前肠内胚层的相互作用。在这篇研究中，研究人员首先将人PSC预铺在Geltrex包被板上，然后在形成 HFO 之前转移至E8培养基中进行培养。通过14天培养，研究人员获得了直径约 2 mm 的类器官。随后，通过对HFO进行荧光显微镜和激光扫描光学断层成像，研究人员确定了HFO的径向对称性生长特性，进一步地免疫荧光实验证实了HFO的结构特点：被密集的心肌层包围 ，并被松散排列的心肌细胞和横隔样细胞覆盖，最终被间充质细胞包围。

Fig.3 HFOs recapitulate pns of early cardiomyogenesis.

随着神经退行性疾病的日益增多，临床上目前仍然缺乏疗效确切的治疗药物，以致神经退行性疾病至今仍无法达到令人满意的治疗效果。而干细胞疗法则为神经退行性疾病的治疗提供了新途径。

在 Nature Genetics 的一篇文章《Molecular and functional variation in iPSC-derived sensory neurons》中，研究人员比较了饲养层系统培养的iPSC (feeder iPSCs)和无饲养层系统培养的iPSC (E8 iPSCs)在基因表达图谱上的巨大差异。

Fig.4 Gene expression variability in IPSDSNs is influenced by differentiation conditions.

Fig.5 Characterization of molecular phenotypes in iPSC-derived sensory neurons.

在这项研究中，研究人员使用107个来自无关的、明显健康的个体的iPSC 谱系进行了123次分化，在经过质控后，研究人员获得了119个iPSC的差异表达样本，并对其中106个P2样本进行了分析（QTL除外）。

Fig.6  A heat map of RNA-seq data for ten marker genes of the two cell clusters identified by SC3

随后，为了减少研究误差，研究人员又使用scRNA-seq对来自同一个体的 177 个 IPSDSN 进行了测序。结果发现IPSDSN与DRG在全基因组表达方面具有较大的相似性。

由于使用iPSC 开展遗传研究的一个核心问题是细胞表型的异质性。这种异质性可能源于供体遗传背景、克隆选择的影响以及重编程和分化过程中细胞培养环境的影响。因此，研究人员又对IPSDSN基因表达的异质性进行了分析，结果表明IPSSSNs 中神经元基因的表达存在较大异质性，这可能是分化变异的结果。

为了进一步探究异质性存在的原因，研究人员对iPSC培养条件进行了比较分析，结果发现神经细胞受分化前的iPSC培养条件的影响。在E8培养基中 iPSCs 分化出的神经元含量更高。同时，研究人员使用RASQUAL和ATAC-seq等方法还发现遗传变异还能够影响感觉神经元的基因表达、剪接和染色质可及性。

综上，这项研究让我们看到了iPSC分化神经元在不同培养基中基因表达差异的巨大变化，尤其是与神经系统发育相关的基因，为我们开展相关研究提供了一个参考。